[發明專利]一種MLD慢病毒載體、慢病毒及其制備方法和應用在審
| 申請號： | 201810549059.4 | 申請日： | 2018-05-31 |
| 公開（公告）號： | CN108707627A | 公開（公告）日： | 2018-10-26 |
| 發明（設計）人： | 朱章英 | 申請（專利權）人： | 深圳市免疫基因治療研究院 |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61K48/00;A61K38/17;A61P3/00;A61P25/28 |
| 代理公司： | 北京品源專利代理有限公司 11332 | 代理人： | 鞏克棟 |
| 地址： | 518000 廣東省深圳市南山區粵海街道粵興二道6號深圳虛*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 慢病毒載體 制備方法和應用 慢病毒 基因 基因治療過程 剪接供體位點 保障安全性 基因傳遞 正常基因 表達量 轉基因 改造 大腦 細胞 傳遞 申請 | ||
1.一種MLD慢病毒載體，其特征在于，所述慢病毒載體為在pTYF慢病毒載體的5’端的剪接供體位點進行改造，具體改造方式如下：
(a)其5’端的剪接供體位點被刪除或改造，改造后的慢病毒載體剪接供體位點不是所述包裝載體和所述參照慢病毒之間的同源重組的潛在位點；
(b)其仍具有病毒包裝信號功能；
其中，所述慢病毒載體還包括ARSA基因。
2.根據權利要求1所述的慢病毒載體，其特征在于，所述ARSA基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示或與其具有至少80％同源性，優選至少85％同源性，進一步優選至少95％同源性的核苷酸序列。
3.根據權利要求1或2所述的慢病毒載體，其特征在于，所述ARSA基因之前還包括啟動子序列；
優選地，所述啟動子序列為EF1α和/或CMV，優選為EF1α；
優選地，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或與其具有至少90％同源性，優選至少95％同源性的核苷酸序列。
4.一種重組慢病毒，其特征在于，將包含如權利要求1-3中任一項所述的慢病毒載體pTYF與包裝輔助質粒pNHP和pHEF-VSV-G共轉染哺乳細胞得到的重組慢病毒；
優選地，所述哺乳細胞為HEK293T細胞和/或TE671細胞。
5.一種制備如權利要求4所述慢病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)將慢病毒載體pTYF 5’端的剪接供體位點進行點突變；
(2)全基因合成啟動子及ARSA基因序列并插入步驟(1)點突變的慢病毒載體中；
(3)將構建的慢病毒載體與包裝輔助質粒共轉染哺乳細胞得到重組慢病毒。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述插入的位點為BamHI和SpeI酶切位點之間。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的包裝輔助質粒為pNHP和pHEF-VSV-G；
優選地，所述哺乳細胞為HEK293T細胞和/或TE671細胞；
優選地，所述共轉染哺乳細胞后的培養時間為24-72h。
8.一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞包括如權利要求1-3中任一項所述的慢病毒載體和/或如權利要求4所述的重組慢病毒；
優選地，所述重組細胞為重組干細胞，優選為外周血干細胞和/或間充質干細胞。
9.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括如權利要求1-3中任一項所述的慢病毒載體、如權利要求4所述的重組慢病毒或如權利要求8所述的重組細胞中的任意一種或至少兩種的組合。
10.如權利要求1-3中任一項所述的慢病毒載體、如權利要4所述的重組慢病毒、如權利要求8所述的重組細胞或如權利要求9所述的藥物組合物在制備MLD治療的藥物和/或試劑中的用途；
優選地，所述組合物還包括藥學上接受的輔料；
優選地，所述輔料為賦形劑、稀釋劑、載體、調味劑、粘合劑和填充劑中的任意一種或至少兩種的組合。
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