[發明專利]檢測人PML-RARa融合基因的試劑盒及其使用方法

在審

• 申請號: 201810548849.0
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN110551816A
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發明（設計）人: 熊慧;謝立群;徐任;陸孟超;陳嘉錚;李云航;高峰英
• 申請（專利權）人: 蘇州云泰生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 11390 北京和信華成知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 胡劍輝

本申請涉及融合基因檢測領域，具體講，涉及一種檢測人PML?RARa融合基因的試劑盒。本申請的采用PCR結合實時熒光探針技術，對臨床外周血標本中的白血病相關融合基因PML?RARa的RNA進行定量檢測，從而輔助白血病臨床診斷并指導相關白血病患者對臨床藥物的選擇，具有高特異性、高準確性和最低檢出量的技術優勢。

技術領域

本申請涉及融合基因檢測領域，具體講，涉及一種檢測人PML-RARa融合基因的試劑盒及其使用方法。

背景技術

白血病(Leukemia)是造血系統的惡性腫瘤，其特征是骨髓、淋巴結等造血系統中一種或多種血細胞發生惡性增殖，并浸潤體內各組織臟器，導致正常造血組織細胞受抑制，產生各種癥狀。白血病臨床上常以發熱、出血、貧血，肝、脾、淋巴結腫大為特點。白血病一般按自然病程和細胞發育程度可分為急性白血病(AL)和慢性白血病(CL)，根據白血細胞的形態和生化特征，又可分為急性淋巴細胞白血病(ALL)、急性非淋巴細胞白血病(ANLL)、慢性粒細胞白血病(CML)、慢性粒－單核細胞白血病(CMML)等。

白血病是國內十大高發惡性腫瘤之一，其發病率為2.76/10萬人口，我國估計有5萬以上患者，且白血病患者的數量正逐年增加。白血病的發病率雖然在腫瘤發病率中排第6位，但在兒童和青少年惡性腫瘤的發病率和死亡率中均占第1位。近年臨床研究表明，大部分白血病和淋巴瘤存在某些染色體畸變，如易位、缺失、插入等。這些染色體易位畸變時大部分情況下會產生新的融合基因，這些融合基因可作為用于診斷不同類型白血病和淋巴瘤的分子標志。不同類型的白血病化療和放療的方案是不同的。所以，對這些分子標記進行檢測分析有利于治療方案的確定和分析預后。因此，世界衛生組織2000年發布的白血病和淋巴瘤診斷標準已將染色體易位后融合基因檢測作為最重要的指標之一。

t(15；17)(q22；q12-21)易位，即15號染色體上的PML基因易位到17號染色體上的RARa基因上形成PML-RARa融合基因，約90％以上的APL患者中可檢測到此融合基因，可作為APL診斷依據、療效評價，以及監測白血病微小殘留狀態的分子指標。

目前對白血病的檢查主要有血象檢查、骨髓涂片檢查、血液生化檢查等，但這些都沒有對融合基因進行檢查，獲得的結果誤差范圍也比較大。目前檢測融合基因的方法主要包括熒光原位雜交技術(FISH)，PCR和基因芯片等。

其中，FISH技術是利用已知的核酸探針，與組織、細胞染色體標本中相關核酸序列雜交，通過間接免疫熒光反應，直接定位基因，適用于多種臨床標本，包括血液，骨髓、組織印片，甚至石蠟包埋的組織標本。由于FISH對處于分裂中期和間期細胞都能檢測，克服了常規的細胞遺傳學診斷淋巴瘤和白血病必須細胞處于分裂中期的障礙，但最低檢出量較低，主要用于初診和復發的檢測。

PCR是檢測融合基因的首選方法，不同類型的白血病和淋巴瘤存在不同的染色體易位，目前檢測融合基因的主要PCR方法有巢式PCR方法，但這些大多是終點PCR方法，而且需要經過電泳檢查，容易污染，極大地抑制了其在臨床的廣泛應用。

基因芯片方法是將許多白血病特異的探針固定在特定的介質上，利用分子之間相互識別的原理，來檢測與探針相互作用的分子。通過基因芯片檢查，可以發現病人骨髓中是否存在染色體易位。但目前該技術尚不夠成熟，尤其是在PCR后的開管取樣用于雜交，對其后的PCR反應，存在著很大的污染隱患，因此有一定的假陽性和假陰性率，且結果不容易解釋，臨床推廣困難。

在熒光定量PCR技術普及前，很多研究學者采用競爭性定量PCR技術對融合基因進行定量分析，但競爭性定量PCR不僅耗時耗力，而且不利于標準化操作的建立，極大限制了其在臨床上的應用。