[發明專利]一種苯并芘免疫原的制備方法及其用途

在審

• 申請號: 201810548486.0
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108715611A
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 莊惠生;馬振
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K16/44;G01N33/68
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 胡永宏

本發明公開了一種苯并芘免疫原的制備方法及其用途，包括：先用苯并芘標準品進行親電取代反應生成6?碘苯并芘，再通過Heck偶聯反應得苯并芘的羰基衍生物BaP＝O即BaP半抗原，然后經肟化反應將BaP半抗原的羰基羧基化，并用活化酯法與牛血清蛋白(BSA)偶聯，得BaP免疫原BSA?BaP；上述合成方法簡單、快速，提供了一種制備特異性強的BaP免疫原的新途徑，可用于制備BaP人工多克隆抗體及建立苯并芘免疫分析檢測方法。

技術領域

本發明屬于生物化學領域，具體涉及一種苯并芘免疫原的制備方法及其用途。

背景技術

苯并芘(BaP)又稱3,4-苯并芘，工業生產和生活過程中煤炭、石油和天然氣等燃料不完全燃燒以及食物在熏制、烘烤和煎炸等高溫烹調過程中都會產生BaP，具有致癌性、致畸性和致突變性，在環境介質中廣泛存在。苯并芘的毒性具有長期和隱匿特性，人體接觸或攝入BaP后能夠在體內蓄積，在表現出癥狀前具有較長潛伏期。由于BaP來源廣泛，且對人體危害性較大，引起了國內外學者的廣泛研究，目前國內外對苯并芘檢測的研究多集中于大氣、水體等環境介質及糧油、肉類等食品，最常用的檢測方法有氣相色譜、氣相色譜-質譜、高效液相色譜等儀器分析方法。

目前，酶聯免疫吸附法(ELISA)用于大批量樣品的快速篩查與檢測，受到廣泛的研究，如Matschulat等制備了BaP單克隆抗體，利用ELISA方法檢測了水中BaP的含量，靈敏度IC₅₀為24ng/mL；Pschenitza等利用固相萃取結合ELISA的方法檢測食用油中的苯并芘，其檢測下限為0.63μg/mg。另外，生物素-親和素-酶聯免疫吸附法(BA-ELISA)等高靈敏度的免疫檢測技術不斷興起，是一種將抗原抗體間的特異性識別免疫反應與酶的高效催化性能以及生物素-親和素系統結合在一起而發展起來的非均相免疫分析技術，即將抗體或抗原生物素化，利用固相包覆的抗原或抗體專一、特異性的識別結合，再利用鏈酶親和素偶聯生物素化抗體，最后通過酶來催化小分子底物產生肉眼可辨別的顏色變化，由于固相載體上結合的酶量與待測物的量呈現一定的量比關系，可實現定性或定量分析。在BA-ELISA方法中，一個親和素分子上的4個亞單位都能分別專一特異性的識別結合一個生物素分子，親和常數高達1015mol/L，提高被固相結合的酶數量，減少與試劑間的非特異性識別反應，提高檢測方法的靈敏度。

上述免疫分析方法均是基于抗原抗體間的特異性識別免疫反應的檢測技術，BaP免疫原的制備是建立檢測BaP免疫分析技術的基礎，BaP分子不含能夠與蛋白質偶聯的活性官能基質，需要在BaP小分子上引入活性官能團，以便與載體蛋白偶聯如氨基、羧基、羰基等。目前關于BaP免疫原的制備方法報道較少，且存在操作復雜、產率較低或所需設備要求較高，有關BaP免疫原制備方法種類較少且單一。

發明內容

本發明的發明人在前期研究的基礎上發現，先用苯并芘標準品進行親電取代反應生成6-碘苯并芘，再通過Heck偶聯反應得BaP半抗原即苯并芘的羰基衍生物BaP＝O，然后經肟化反應將BaP半抗原的羰基羧基化，并用活化酯法與牛血清蛋白(BSA)偶聯，得BaP免疫原BSA-BaP。本發明提供了一種制備特異性強的BaP免疫原的新途徑，合成方法簡單、快速，可用于制備BaP人工多克隆抗體及建立苯并芘的免疫分析檢測方法。

本發明的上述目的通過以下技術方案實現：

一種苯并芘免疫原，結構式如式(Ⅰ)所示，

本發明的第二方面，上述苯并芘免疫原的制備方法，合成路線如式(Ⅱ)所示，

具體地，包括以下步驟：

(1)用苯并芘標準品進行碘代反應，在室溫下反應48h得中間產物6-碘苯并芘，并通過展開劑為甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄層色譜監測上述反應至原料消失為止；