[發(fā)明專利]一種苯并芘免疫原的制備方法及其用途

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810548486.0
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108715611A
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 莊惠生;馬振
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K16/44;G01N33/68
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 胡永宏

1.一種苯并芘免疫原，結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示，

2.如權(quán)利要求1所述苯并芘免疫原的制備方法，其特征在于，合成路線如式(Ⅱ)所示，

包括以下步驟：

(1)用苯并芘標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行碘代反應(yīng)，室溫下反應(yīng)48h，得中間產(chǎn)物6-碘苯并芘；

(2)步驟(1)中所得6-碘苯并芘進(jìn)行Heck偶聯(lián)反應(yīng)，在120℃的條件下反應(yīng)15h，分離凈化，得BaP半抗原；

(3)通過肟化反應(yīng)將步驟(2)中所得BaP半抗原的羰基羧基化，得BaP羧基衍生物，以BSA為載體蛋白，經(jīng)活化酯法將上述BaP羧基衍生物與BSA偶聯(lián)，即得。

3.如權(quán)利要求2所述苯并芘免疫原的制備方法，其特征在于，所述苯并芘免疫原的具體制備過程為：

(1-1)取500mL三口圓底燒瓶，分別加入0.4g苯并芘、0.42gNIS、10g酸性氧化鋁和30mL甲苯，室溫攪拌反應(yīng)48h，并通過展開劑為甲基叔丁醚:石油醚＝1:25(v/v)的薄層色譜監(jiān)測上述反應(yīng)至原料消失為止；再將上述反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)過濾后合并有機(jī)相，分別用飽和亞硫酸鈉溶液、飽和NaCl溶液和超純水各萃取三次，將所述有機(jī)相經(jīng)無水MgSO₄干燥、過濾、減壓濃縮和重結(jié)晶提純，得黃色粉末狀固體物；

(2-1)向100mL單口燒瓶中分別加入0.27mg步驟(1-1)中黃色粉末狀固體物、0.01g醋酸鈀和0.02gLiCl，加入20mLDMF溶解，再依次加入70μL4-戊烯-2-醇和200μL三乙胺，120℃攪拌反應(yīng)15h，并通過展開劑為甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的薄層色譜監(jiān)測上述反應(yīng)至反應(yīng)完全；再將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至室溫并加入120mL甲苯，分別用飽和NaCl溶液和超純水各萃取三次，所述有機(jī)相經(jīng)無水MgSO₄干燥、過濾和減壓濃縮得粗產(chǎn)品，再經(jīng)淋洗液為甲基叔丁醚:石油醚＝1:2(v/v)的硅膠色譜柱分離凈化，得淺黃色粉末狀產(chǎn)物；

(3-1)取0.12g步驟(2-1)中淺黃色粉末狀產(chǎn)物、0.24g羧甲氧基胺半鹽酸鹽溶于15mL干燥吡啶中，在避光條件下震蕩反應(yīng)，并通過展開劑為氯仿:甲醇＝9:1(v/v)的薄層色譜監(jiān)測上述反應(yīng)至反應(yīng)完全；待反應(yīng)完全后，取0.54g硼氫化鈉溶于4.5mL超純水中，加入到上述反應(yīng)液內(nèi)，室溫震蕩反應(yīng)5h，氮吹后的殘渣分別用pH2.0鹽酸溶液、蒸餾水洗滌兩次，60℃烘箱中烘干，得黃色固體產(chǎn)物；再稱取0.823g上述黃色固體產(chǎn)物溶于0.5mLDMF中，將0.023gN-羥基琥珀酰亞胺、0.412g二環(huán)己基碳二亞胺溶解于0.5mLDMF后，加入到上述溶液中4℃攪拌反應(yīng)8h；再在6000rpm、4℃下高速離心20min，取上清液加入5mLBSA溶液，4℃下攪拌反應(yīng)過夜；重復(fù)離心，將上清液用0.01M、pH7.40磷酸鹽緩沖液透析3d，-20℃下保存，即得。

4.如權(quán)利要求3所述苯并芘免疫原的制備方法，其特征在于，步驟(1-1)中所述黃色粉末狀固體物為6-碘苯并芘，且產(chǎn)率為76.2％。

5.如權(quán)利要求3所述苯并芘免疫原的制備方法，其特征在于，步驟(1-1)中所述重結(jié)晶提純的溶劑為二氯甲烷和石油醚的混合物。

6.如權(quán)利要求3所述苯并芘免疫原的制備方法，其特征在于，步驟(2-1)中所述淺黃色粉末狀產(chǎn)物為苯并芘半抗原，分子式為C₂₇H₂₀O，且產(chǎn)率為86.2％。

7.如權(quán)利要求3所述苯并芘免疫原的制備方法，其特征在于，步驟(3-1)中，所述黃色固體產(chǎn)物為BaP羧基衍生物，結(jié)構(gòu)式為BaP-COOH。

8.如權(quán)利要求1所述苯并芘免疫原在制備BaP人工多克隆抗體中的應(yīng)用。

9.如權(quán)利要求1所述苯并芘免疫原作為痕量BaP免疫分析檢測的用途。