[發明專利]引物5’端反向互補的熒光PCR

在審

• 申請號: 201810544265.6
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108796047A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 江洪;江和來
• 申請（專利權）人: 江洪
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 俞梁清

引物5'端反向互補的熒光PCR，屬于分子生物學?核酸擴增技術領域，其特征是一對引物5'端添加一段序列反向互補的熒光PCR擴增，帶來擴增產物間末端互補，靶產物3'末端也可以互為模板、互為引物而增加擴增效率，在常規PCR指數放大10^9?12基礎上再增加靈敏度50倍，或同樣靈敏度情況下可少擴增5個循環；另一面引物5'端互補不會延伸反而抑制原引物對3'末端間的聚合非特異性或少擴增5個循環可避開引物非特異擴增區。聯合中部同序與3'最末端倒數第1?2個堿基A腺嘌呤結尾的引物+UDG酶解dU代替dT的擴增產物,和礦物油密閉使PCR反應循環內無引物二聚體PD產生及杜絕產物氣霧膠交叉污染。

技術領域：

本發明屬于分子生物學及核酸檢驗的熒光PCR技術領域，具體地增加引物5'端互補序列以超過指數放大來提高靈敏度和限制引物非特異性的單管一步法實時熒光PCR。

背景技術：

多聚酶鏈反應PCR是在1953年Watson建立的DNA雙螺旋模型及半保留復制法則基礎上，體外(試管內)模擬自然基因復制的核酸擴增技術，早在1971年Khorana就已發表了一核酸體外擴增(J.Molec.Biol.,56:341)相關論文；但直到1985年美國Cetus公司Mullis想到了PCR本質-指數擴增或幾何級數式放大的巨大威力,才發明了一對特異引物結合、復制靶分子基因,模擬天然DNA半保留復制的PCR技術，再經過一系列發展和耐熱聚合酶、熱循環儀的發明、應用，Cetus公司于1987年申請了首個PCR發明專利(US Patent 4,683,202)。

擴增利用熱循環高效解鏈，一般經高溫變性：靶DNA經94℃使雙鏈解離成為單鏈；退火復性：降溫至54℃左右使過量引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物延伸：升溫至72℃左右，DNA單鏈模板—引物結合物在耐熱DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，遵循堿基反向配對復制，引物末端按5'→3'方向延伸、合成一條新的與模板DNA鏈反向互補的復制鏈，子代一半新鏈一半母鏈半保留復制；不斷重復循環變性--退火--延伸三過程，這種新鏈又可成為下次循環的模板，靶分子以2ⁿ級數產生更多的新鏈。

各種PCR方法，改進不斷涌現,發明，包括反轉錄RT-PCR,原位PCR,連接酶鏈反應(LCR)，標記PCR(Labeled primers-PCR)，反向PCR(reverse PCR)，不對稱PCR(asymmetricPCR)，降落PCR(touchdown PCR)，重組PCR(recombinant PCR)，多重PCR(multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA差異PCR，鏈替換擴增(SDA)，依賴核酸序列的擴增(NASBA)，轉錄依賴的擴增系統(TAS)，Qβ復制酶(Q-beta replicase)催化RNA擴增,滾環擴增(RCA),環介導的等溫擴增(LAMP)等。由于常規終末PCR因同樣量的樣本經PCR超級放大以后變化太大而產量不均一，致使難以定量檢測，傳統的終末/終點PCR只能PCR后凝膠電泳來區分特異與非特異擴增條帶；1997年采用動態實時檢測擴增對數期的循環數與靶初始量成反比(反對數關系)的實時熒光PCR(Real-time PCR)技術實現了從定性測定到精確定量的飛躍，根據發光原理有以SYBR Green Ⅰ等結合產物DNA雙鏈小溝后使發射熒光增強1000倍的染料法實時熒光PCR和各種熒光標記雜交探針實時PCR兩大類(Bio Techniques 1997,22:130-138)。