[發(fā)明專利]引物5’端反向互補的熒光PCR

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810544265.6
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108796047A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設計）人: 江洪;江和來
• 申請（專利權）人: 江洪
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 俞梁清

1.引物5'端反向互補的熒光PCR，其特征是一對引物5'端添加一段序列反向互補的熒光PCR擴增，帶來擴增產物間末端互補，靶產物3'末端間也可以互為模板、互為引物而增加擴增效率，以＞2ⁿ級數(shù)放大策略而增敏；另一面引物5'端互補不會延伸反而抑制原引物對3'末端間的聚合非特異性，聯(lián)合3'最末端倒數(shù)第1-2個堿基A/a腺嘌呤結尾的引物+UDG酶解dU代替dT的擴增產物,和礦物油封閉來杜絕產物尤其引物二聚體PD氣霧膠污染，具有如以下技術途徑：

(1)一對引物5'端均加上一段短于引物長度2-5b的反向5-10b互補人工序列，根據(jù)擴增產物鏈3'末端與引物互補并而為下一輪循環(huán)反應模板的現(xiàn)象，一對5'互補引物擴增產物鏈3'末端間相應地也互相互補，擴增產物3'末端不僅為后續(xù)循環(huán)結合引物的模板，產物3'末端人工序列間也可以互為模板、互為引物結合、延伸，放大效率超過＞2ⁿ指數(shù)或幾何級數(shù)，實現(xiàn)增強PCR擴增靈敏度；

(2)利用引物5'自身的序列作為“人工互補序列”，將一條引物5'端序列對應的5-8b反向互補序列按5'-3'方向加到另一條引物5'端前面，反之，另一條引物5'端的反向互補序列加一段至對應引物5'前面，形成兩段連續(xù)5'反向互補序列而增敏，原引物與添加序列共用了一段引物5'自身序列，原引物序列與添加的序列間可插入一短4b序列限制酶切位點，使增敏PCR產物酶切后長度一致以便于電泳回收和有助于降解PD產物污染。

2.根據(jù)權利要求1所述的引物5'端反向互補的熒光PCR，其特征在于：所述上下游原引物具有中部6-8b同序/相同堿基序列A結尾的引物，用于進一步減少引物二聚體程度/推后引物二聚體本底擴增Ct值；加入引物中部互補的反義堿基5-9b中部干擾Oligo寡核苷酸增效劑，選擇性抑制PCR反應內的引物二聚體擴增本底Ct值。

3.根據(jù)權利要求1所述的引物5'端反向互補的熒光PCR，其特征在于：所述原引物中部6-8b同序A結尾引物的尾堿基A前或后緊鄰堿基變一個RNA，讓A結尾和RNA堿基聯(lián)合共同消化引物二聚體PD產物污染。

4.根據(jù)權利要求2所述的引物5'端反向互補的熒光PCR，其特征在于：所述的引物設計在常規(guī)引物選取基礎上修改和增補一些減少本底、5'端反向互補引物設計原則：

(1)選取一對靶特異性基因跨度100-300bp兩端序列17-22個核苷酸堿基長度作為上下游引物，且引物3'末端間不能有連續(xù)反向互補；

(2)選取靶基因跨度300bp以內6-8b“倒置重復”置于一對引物離3'端2-6個堿基以外的中部作為中部同序引物；

(3)5'端反向互補—采用5-7b對側原引物5'反向序列作為添加人工序列加至相對引物前面，人工添加的序列與原引物序列間插入一短4b序列限制酶切位點；

(4)一對引物的3'最末堿基選擇A/AC結尾使擴增產物對應dU位于二聚體的原引物連接中間處；不要選氫鍵強“錯配”多的G結尾,亦不要選氫鍵弱/特異性差的T結尾,更不能采用重復雙GG/TT結尾。

5.根據(jù)權利要求1所述的引物5'端反向互補的熒光PCR，其特征在于，所述的引物濃度為3-6μM作為50×倍或終濃度0.1μM，隨不同樣本最低濃度檢測要求及系統(tǒng)本底值需要調整最佳引物濃度。

6.根據(jù)權利要求1所述的引物5'端反向互補的熒光PCR，其特征在于：PCR反應液添加含甜菜堿和聚陰離子多聚磷酸通用PCR增效劑，雙向增強靶擴增效率和抑制PD非特異性擴增。

7.根據(jù)權利要求1所述的引物5'端反向互補的熒光PCR，其特征在于：聯(lián)合礦物油密閉PCR反應情況下采用一成分如一引物含10％蔗糖分層緩慢釋放-結合熱啟動PCR以減少氣霧膠產量或產生無效擴增氣霧膠。