[發(fā)明專利]一種快速檢測(cè)溶血性曼氏桿菌的PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810543513.5
• 申請(qǐng)日: 2018-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108728558A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李軍;吳翠蘭;彭昊;潘艷;馮世文;陶立;李常挺;胡帥;馬春霞;謝永平;鐘舒紅;賀會(huì)利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

本發(fā)明公開(kāi)一種快速檢測(cè)溶血性曼氏桿菌的PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物細(xì)菌學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述PCR擴(kuò)增引物由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成；上述引物用于制備檢測(cè)溶血性曼氏桿菌的PCR擴(kuò)增試劑盒。該試劑盒提供的PCR檢測(cè)方法具有高度的特異性和敏感性，重復(fù)性好，可信度高，快速準(zhǔn)確的獲得檢測(cè)結(jié)果，同時(shí)價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便，解決了傳統(tǒng)鑒別方法分離率低，耗時(shí)費(fèi)力等不足，適合基層使用，可作為溶血性曼氏桿菌實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查的一種快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動(dòng)物細(xì)菌學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速、簡(jiǎn)便、低成本檢測(cè)溶血性曼氏桿菌的PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica ）屬于巴氏桿菌科，為革蘭陰性的球桿菌，是存在于牛、綿羊、山羊等反芻動(dòng)物以及其他多種動(dòng)物上呼吸道的常在菌和機(jī)會(huì)致病菌。在某些誘發(fā)因素作用下，溶血性曼氏桿菌可導(dǎo)致上述動(dòng)物引發(fā)致死性肺炎。病毒和支原體的感染使得機(jī)體溶血性曼氏桿菌更易感，如副流感病毒及綿羊肺炎支原體等。此外，環(huán)境驟變、運(yùn)輸?shù)仍斐傻臋C(jī)體應(yīng)激以及動(dòng)物整體健康狀況降低均可以使這兩種細(xì)菌引發(fā)呼吸道疾病或影響疾病的嚴(yán)重程度。目前，溶血性曼氏桿菌在全球范圍內(nèi)均有分布，給養(yǎng)牛業(yè)、養(yǎng)羊業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。在臨床上，溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌不僅可以單獨(dú)感染，兩者也可以繼發(fā)感染或混合感染，且引起的呼吸道癥狀相似，這為采取針對(duì)性的防治措施帶來(lái)困難。

常規(guī)的鑒別溶血性曼氏桿菌的方法是病原分離鑒定，即通過(guò)對(duì)細(xì)菌的表型特征和生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，但該鑒定方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)。此外，由于溶血性曼氏桿菌和多殺性巴氏桿菌在形態(tài)大小、染色特性等方面極為相似，為準(zhǔn)確鑒別這兩種細(xì)菌的造成困難，并且經(jīng)常無(wú)法準(zhǔn)確鑒別這兩種細(xì)菌。因此，建立一種可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒定溶血性曼氏桿菌的方法在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供低成本、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)溶血性曼氏桿菌的PCR擴(kuò)增引物及其應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，使用如下的技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)溶血性曼氏桿菌的PCR擴(kuò)增引物，是依據(jù)溶血性曼氏桿菌gcp基因進(jìn)行設(shè)計(jì)，擴(kuò)增的目的片段大小為220 bp，所述PCR擴(kuò)增引物引物的序列分別為：

Forward primer：5ˊ- GGGCAATACGAACTACTCGG -3ˊ SEQ ID NO:1

Reverse primer：5ˊ- TCGTATTCGCAGCAAAGGTT -3ˊ SEQ ID NO:2

使用前將引物濃度稀釋至25 pmol/μL。

優(yōu)選的，將所述PCR 擴(kuò)增引物在制備檢測(cè)溶血性曼氏桿菌試劑盒的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種快速檢測(cè)溶血性曼氏桿菌的PCR擴(kuò)增試劑盒，所述PCR擴(kuò)增試劑盒包括具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。

優(yōu)選的，，所述PCR擴(kuò)增試劑盒還包括PCR預(yù)混液和RNase-Free water；所述的PCR預(yù)混液由PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA組成，利用快速檢測(cè)溶血性曼氏桿菌的PCR擴(kuò)增試劑盒建立PCR擴(kuò)增方法，其反應(yīng)體系建立以25 μL計(jì)，其中

PCR 預(yù)混液 12.5 μL

Forward primer（25 pmol/μL） 1μL

Reverse primer（25 pmol/μL） 1μL