[發明專利]一種快速檢測肺炎克雷伯氏菌的PCR擴增引物及其應用

在審

• 申請號: 201810543504.6
• 申請日: 2018-05-31
• 公開（公告）號: CN108531629A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 李軍;吳翠蘭;彭昊;潘艷;馮世文;陶立;李常挺;馬春霞;謝永平;鐘舒紅;胡帥;賀會利
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/22
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

本發明公開了一種快速檢測肺炎克雷伯氏菌的PCR擴增引物及其應用，屬于動物細菌學及分子生物學領域。所述PCR擴增引物由具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的下游引物組成；上述引物用于制備檢測肺炎克雷伯氏菌的PCR擴增試劑盒。該試劑盒提供的PCR檢測方法具有高度的特異性和敏感性，重復性好，可信度高，特異性檢測出肺炎克雷伯氏菌，快速準確的獲得檢測結果，同時價格低廉、操作簡便，適合基層使用，可作為肺炎克雷伯氏菌實驗室快速鑒別和大規模流行病學調查的一種快速、準確、簡便的檢測工具。

技術領域

本發明涉及動物細菌學及分子生物學技術領域，具體說是涉及一種快速、簡便、低成本檢測肺炎克雷伯氏菌的PCR擴增引物及其應用。

背景技術

肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumonia, Kpn）為腸桿菌科克雷伯氏菌屬的革蘭氏陰性菌。可侵害人和動物的腸道、呼吸道等器官，從而可引起肺炎、肝膿腫、傷口感染和敗血癥等癥狀，是一種人獸共患病的病原。同時，牛感染肺炎克雷伯氏菌后，對多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌以及牛支原體等病原的易感性增加。目前，該病原體在全球范圍內均有分布，在中國的分布流行同樣十分廣泛，造成巨大的經濟損失，成為威脅牛養殖業的重要病原之一。

迄今為止，國內外檢測的肺炎克雷伯氏菌的手段報道較少。主要有ELISA方法、細菌培養分離革蘭氏染色鑒定、生化試驗等。這些技術不僅耗時長，且檢測不靈敏，而PCR方法不僅可以快速靈敏診斷出病原，而且對于潛伏期的病原感染，其特異性更強。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有技術中存在的問題，提供一種低成本、快速、準確地檢測肺炎克雷伯氏菌的PCR擴增引物及其應用。為實現本發明目的所使用的技術方案為：包括樣品采集，病原基因組DNA的提取，特異性引物的設計和優化，PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物和結果判定。

一種快速檢測肺炎克雷伯氏菌的PCR擴增引物，所述的PCR擴增引物是依據肺炎克雷伯氏菌的phoE基因進行設計，擴增的目的片段大小為571bp，引物的序列分別為：

Forward primer：5’- CCATGCACTACTTCAGCGAT -3’ SEQ ID NO:1

Reverse primer：5’- CAGGCTTCCGCTTTCGAAC -3’ SEQ ID NO:2

使用前將引物濃度稀釋至25 pmol/μL。

優選的，將所述的PCR 擴增引物在制備檢測肺炎克雷伯氏菌試劑盒的應用。

本發明還提供一種快速檢測肺炎克雷伯氏菌的PCR擴增試劑盒，包括具有SEQ IDNO:1 所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物。

優選的，還包括10×PCR Buffer、dNTPs、ES-Taq DNA聚合酶和RNase-Free water，利用快速檢測肺炎克雷伯氏菌的PCR擴增試劑盒建立PCR擴增方法，其反應體系建立以25 μL計，

10×PCR Buffer 5 μL

dNTPs（10mM each ） 2 μL

ES-Taq DNA聚合酶（5U/μL） 1 μL

Forward primer（25 pmol/μL） 1 μL

Reverse primer（25 pmol/μL） 1 μL

DNA模板 3 μL