[發明專利]一種雜交鵝掌楸親緣關系的鑒定方法

有效

• 申請號: 201810543423.6
• 申請日: 2018-05-29
• 公開（公告）號: CN108660196B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 陳金慧;龍曉飛;施季森;成鐵龍;肖保榮;劉思芹;翁禹豪;胡凌峰;劉陽
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6895
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種雜交鵝掌楸親緣關系鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取后代樹種的葉片DNA；

2)進行PCR檢測；

3)用引物18.2能特異性擴增出400bp的產物的母本為中國鵝掌楸，能特異性擴增出382bp的產物母本為北美鵝掌楸；

4)再用引物700對已鑒別為母本為中國鵝掌楸的進行PCR擴增，能特異性擴增出700bp產物的母本為中國鵝掌楸西部種源，能特異擴增出242bp產物的母本則為中國鵝掌楸東部種源；對已鑒別為母本為北美鵝掌楸的用引物700進行PCR擴增，均特異獲得700bp的產物。

2.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸親緣關系的鑒定方法，其特征在于，步驟1)中，葉片為剛展開的嫩葉，液氮處理后放置-80℃備用。

3.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸親緣關系鑒定方法，其特征在于，步驟2)中，DNA提取采用CTAB法進行。

4.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸親緣關系鑒定方法，其特征在于，步驟3)中，PCR擴增的10μL體系為：75ng基因組DNA，1.0μL 10×PCR Buffer，1.2μL 2.5mM·L^-1MgCl，0.2μL10mM·L^-1dNTP，0.5μL 10μM·L^-1引物18.2左端引物，0.5μL 10μM·L^-1引物18.2右端引物和0.5個單位Taq酶，ddH₂O補足10μL，其中，引物18.2左端引物序列為：AATTCTCTCAATTTCACTTTGCCT；引物18.2右端引物序列為：TGGTCGATGCATTCTGTTTCT。

5.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸親緣關系鑒定方法，其特征在于，步驟3)中，采用Touch-downPCR擴增程序：95℃預變性4min，94℃變性15s，60℃(△＝-1℃)復性30s，72℃延伸30s，6個循環；94℃變性15s，55℃復性30s，72℃延伸30s，24個循環，72℃延伸10min，4℃保存。

6.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸親緣關系鑒定方法，其特征在于，步驟4)中，10μLPCR擴增的體系為：75ng基因組DNA，1.0μL 10×PCR Buffer，1.2μL 2.5mM·L^-1MgCl，0.2μL10mM·L^-1dNTP，0.5μL 10μM·L^-1引物700左端引物，0.5μL 10μM·L^-1引物700右端引物和0.5個單位Taq酶，ddH₂O補足10μL，其中，引物700左端序列為：TATGGTATATTCTATTCGGTT；引物700右端序列為：TCATTCCAATTCTACCGAT。

7.根據權利要求1所述的雜交鵝掌楸親緣關系鑒定方法，其特征在于，步驟4)中，采用Touch-downPCR擴增程序為：95℃預變性4min，94℃變性15s，58℃(△＝-1℃)復性30s，72℃延伸45s，6個循環；94℃變性15s，55℃復性30s，72℃延伸45s，24個循環，72℃延伸10min，4℃保存。

8.權利要求1所述的雜交鵝掌楸親緣關系鑒定方法的專用試劑盒，其特征在于，至少包括用量為1次以上的引物試劑，所述的引物試劑的引物序列為：引物18.2左端引物序列為：AATTCTCTCAATTTCACTTTGCCT；引物18.2右端引物序列為：TGGTCGATGCATTCTGTTTCT；引物700左端序列為：TATGGTATATTCTATTCGGTT；引物700右端序列為：TCATTCCAATTCTACCGAT。

9.根據權利要求8所述的專用試劑盒，其特征在于，還包括DNA標樣試劑、DNA提取試劑、電泳試劑中的一種以上；所述的DNA標樣至少包含242bp、382bp、400bp以及700bp四個條帶。

10.權利要求8或9所述的專用試劑盒在雜交鵝掌楸親緣關系鑒定中的應用。