[發明專利]一種轉氨酶、突變體及其生產L-草銨膦的應用

有效

• 申請號: 201810540980.2
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108660122B
• 公開（公告）日: 2020-11-13
• 發明（設計）人: 金利群;鄭裕國;彭鳳;程峰;柳志強;薛亞平;賈東旭
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/04;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種轉氨酶、突變體及其生產L?草銨膦的應用，所述突變體是將SEQ ID NO：2所示氨基酸第62位的異亮氨酸取代為纈氨酸、第74位的絲氨酸取代為蘇氨酸、第93位的甲硫氨酸取代為異亮氨酸、第167位的酪氨酸取代為苯丙氨酸、第220位的丙氨酸取代為脯氨酸、第282位的精氨酸取代為賴氨酸、第353位的丙氨酸取代為絲氨酸、第355的異亮氨酸取代為纈氨酸。轉氨酶以4?(甲基羥基磷酰基)?2?羰基?丁酸為底物制備L?草銨膦，產物ee99.9％，4h底物轉化率為56.31％。轉氨酶突變體產物ee99.9％，4h底物轉化率為95.42％。

(一)技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及到轉氨酶序列熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens ZJB09-108)的基因，表達載體、基因工程菌及其在制備不對稱手性胺化合物中的應用。

(二)背景技術

轉氨酶(Amine Transaminase,ATA,EC2.6.1.X)屬于轉移酶類，是催化氨基供體上的氨基轉移到潛手性的酮類化合物上，得到手性胺和副產物酮或者α-酮酸的一類酶，反應過程需要磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)的參與，其催化的反應是可逆的。轉氨酶廣泛存在于自然界中并在細胞的氮代謝過程中發揮著重要的氨基轉移作用。在一般情況下，所有的轉氨酶都可根據在其可逆反應中所利用的氨基酸底物進行分類，根據其催化活力最大的氨基酸來命名，比如天冬氨酸轉氨酶和苯丙氨酸轉氨酶的氨基供體最適底物分別為天冬氨酸和苯丙氨酸；而根據氨基被轉移到不同位置的氨基受體上，轉氨酶又可以被分為α-轉氨酶和ω-轉氨酶。α-轉氨酶需要一個α位置的羰基受體來發揮其催化功能，但轉氨酶在原則上可以催化轉化任何結構的酮和胺，因而具有更高的應用價值。ω-轉氨酶反應過程可分為兩步，第一步反應是在ω-轉氨酶的作用下將氨基供體上的氨基轉移到PLP的羰基上，從而形成5-磷酸吡哆胺(PMP)和與氨基供體對應的酮；第二步反應同樣在ω-轉氨酶的作用下將PMP上的氨基轉移到氨基受體上，PMP又轉變為PLP實現循環。

隨著社會經濟的不斷發展，手性胺類化合物是非常重要的藥物和藥物中間體，在制藥行業和農業、化工等方面發揮著越來越重要的作用，大量高純度的手性化合物應用到其中。目前，手性胺類化合物的制備方法主要是化學合成和生物合成的方法。化學合成手性胺化合物雖然工藝和技術比較成熟，但其反應操作復雜，反應條件苛刻，產物收率和產物對映過量體ee值不高，而且容易造成環境的嚴重污染。相比較于化學合成方法，生物合成方法的顯著優點在于它的理論產率可以達到100％，而且反應條件溫和，成本較低，對環境污染小，可以制得大量的光學純度較高的手性胺類化合物。隨著重組DNA技術和基因合成等新興技術的不斷發展，一些用于生物催化的酶能夠迅速的被識別和生產，并且可以得到更加穩定和有效的生物催化劑，正因這些先進技術的發展，為利用生物催化劑工業化合成手性胺類化合物的研究開辟了新的角度。特別是重組DNA技術促進了生物催化工藝學的發展。目前，利用酶催化不對稱合成手性胺類化合物主要應用的是氨基脫氫酶和ω-轉氨酶。ω-轉氨酶不僅可應用于對外消旋體的拆分，還可以催化前體酮底物不對稱合成手性胺類化合物，產物的光學純度較高，制備手性胺類化合物范圍較廣，因此更具有應用價值。現在已經在多個種屬的野生菌中發現了ω-轉氨酶，其中包括弧菌(Vibrio fluvialis)、節桿菌(Arthrobacter sp.)、色桿菌(Chromobacterium violaceum)等。Koszeiewski等在利用ATA-117轉化4-苯基-2-丁酮合成R-4-苯基丁-2-胺的過程中，綜合運用有機溶劑DMSO萃取和調整pH的方法使反應物的轉化率達到92％，ee值高達99％。Yun等利用能共同表達產生ω-轉氨酶和乙酰乳酸合酶的基因重組菌Escherichia coli，以整細胞的形式催化苯乙酮不對稱合成苯乙胺，通過在反應體系中加入乳酸脫氫酶，除去丙酮酸的方法改變反應的熱力學平衡，同時又降低了產物抑制。在轉氨酶和乳酸脫氫酶的共同作用下，4-苯基-2-丁酮轉化成-4-苯基-2-丁胺，轉化率達到99％，ee值大于99％。