[發明專利]一種重組表達載體、重組表達宿主及其用于合成腺苷三磷酸的方法

有效

• 申請號: 201810540239.6
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108753808B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發明（設計）人: 楊勇;江林林;吳磊;許海霞;黃堅麗;張永進;徐期
• 申請（專利權）人: 浙江海正藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P19/32
• 代理公司: 北京信諾創成知識產權代理有限公司 11728
• 代理人: 尹吉偉

本發明屬于生物工程領域，涉及腺苷三磷酸的制備。本發明提供了一種重組表達載體以及包含所述載體的重組表達宿主，所述重組表達載體包含編碼腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸；本發明還提供了使用所述重組表達宿主合成腺苷三磷酸的方法。本發明通過使用所述重組表達宿主全細胞催化合成腺苷三磷酸，提高了腺苷轉化率、ATP產率和反應效率，同時反應體系組分簡單、成本低。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及腺苷三磷酸的制備。

背景技術

腺苷三磷酸(ATP)是生物體內重要的代謝物質，分子量為507，分子式為C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃，作為代謝中間體、輔酶和能量供體參與生物體內多種生化反應，是生命活動及生化反應所必需的高能化合物；在體外，ATP常作為酶反應的輔底物應用于工業產品如谷胱甘肽的生產。在臨床上，ATP也常用于進行性肌肉萎縮、心肌梗塞、心肌炎等疾病的輔助治療。

合成ATP的方法主要有化學合成法、生物酶催化法、微生物酶系發酵等。目前用于工業化生產的方法主要是以腺苷或腺苷一磷酸(AMP)作為底物，利用酵母菌糖酵解途徑中的酶系合成ATP，但是該法存在著反應體系復雜、分離純化困難、反應過程不易控制、產品批次間質量差異大等問題。

酶催化法相比發酵法而言，具有高效穩定、反應體系簡單、反應過程容易控制等優點。如Akihiko MARUYAMA等(Akihiko MARUYAMA,Tatsuro FUJIO.ATP Production fromAdeine by a Self-coupling Enzymatic Process:High-level Accumulation underAmmonium-limited Conditions,Biosci,Biotechnol,Biochem.,65(3):644-650)報道了以腺嘌呤為底物，在產氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)催化下合成ATP，反應28h后積累的ATP量達到117mmol/L，底物轉化率達到82％。專利申請CN 106191170A公開了分別構建表達腺苷激酶、腺苷酸激酶和多聚磷酸-腺苷酸磷酸轉移酶的重組菌株，經提取或純化后，三種酶以游離酶或固定化酶形式轉化腺苷，生成ATP。

然而，在ATP合成領域，對于具有高底物轉化率、高ATP產率、高反應效率，同時反應體系組分簡單、成本低的方法仍存在需求。

發明內容

本發明的目的在于提高ATP合成的底物轉化率、ATP產率，提高反應效率，同時簡化反應體系組分，以便于操作和后續分離純化、節約成本。為實現以上目的，本發明提供了一種包含編碼腺苷激酶(AK，EC 2.7.1.20)、腺苷酸激酶(ADK，EC 2.7.4.3)和乙酸激酶(ACK，EC 2.7.2.1)的多核苷酸的表達載體以及相關宿主；以及利用所述宿主細胞全細胞催化合成腺苷三磷酸的方法。

本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案實現的：

第一個方面，本發明提供了一種重組表達載體，其包含編碼腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸。

其中，編碼腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸可以以任何合適的方式存在于表達載體中，如位于不同的操縱子中，或位于同一操縱子中。在特定的實施方式中，分別編碼腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸在同一操縱子中順序排列。所述順序排列表示三種酶的多核苷酸在同一操縱子中在啟動子之后依次排列，三者順序不唯一，可以按照實際要求或操作而定。