[發(fā)明專利]一種重組表達(dá)載體、重組表達(dá)宿主及其用于合成腺苷三磷酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810540239.6
• 申請(qǐng)日: 2018-05-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108753808B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊勇;江林林;吳磊;許海霞;黃堅(jiān)麗;張永進(jìn);徐期
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江海正藥業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12P19/32
• 代理公司: 北京信諾創(chuàng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11728
• 代理人: 尹吉偉

1.一種重組表達(dá)宿主，其包含重組表達(dá)載體；所述重組表達(dá)載體包含：分別編碼腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸，所述分別編碼腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核苷酸位于同一操縱子中；其中，編碼所述腺苷激酶的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示，編碼所述腺苷酸激酶的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示，編碼所述乙酸激酶的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:3所示；所述表達(dá)載體為pET24a；所述宿主是大腸桿菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)宿主，其中，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組表達(dá)宿主，其中，分別編碼腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶的多核核苷酸在同一操縱子中順序排列。

4.如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)宿主或其表達(dá)產(chǎn)物或其菌懸液或其破碎物用于合成腺苷三磷酸的用途。

5.一種合成腺苷三磷酸的方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)宿主，并誘導(dǎo)所述腺苷激酶、所述腺苷酸激酶和所述乙酸激酶的表達(dá)；

(2)向步驟(1)的反應(yīng)體系中添加腺苷，同時(shí)按比例添加乙酰磷酸和/或其鹽，以進(jìn)行催化合成，其中所述反應(yīng)體系中還包含鎂離子以及起緩沖作用的陰離子和陽(yáng)離子。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟(1)中，所述誘導(dǎo)使用的誘導(dǎo)劑是乳糖。

7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中步驟(2)的反應(yīng)溫度為20-50℃，反應(yīng)pH為6.0-9.0；添加的腺苷濃度為10-30mmol/L，且添加的乙酰磷酸和/或其鹽的摩爾濃度為反應(yīng)添加的腺苷的摩爾濃度的1-6倍；所述重組表達(dá)宿主的菌體用量為1-20g/L；鎂離子濃度為1-100mmol/L，所述起緩沖作用的陽(yáng)離子的濃度為1-100mmol/L，和/或所述起緩沖作用的陰離子的濃度為1-100mmol/L。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，步驟(2)的反應(yīng)溫度為30-40℃，反應(yīng)pH為7.0-8.5，鎂離子濃度為5-10mmol/L；所述起緩沖作用的陽(yáng)離子的濃度為100mmol/L；和/或所述起緩沖作用的陰離子的濃度為50mmol/L。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，步驟(2)的反應(yīng)溫度為35℃；反應(yīng)pH為7.5。

10.根據(jù)權(quán)利要求5～9任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(1)之前還包括：分別擴(kuò)增編碼所述腺苷激酶、所述腺苷酸激酶和所述乙酸激酶的多核苷酸，進(jìn)而構(gòu)建包含編碼三種酶的多核苷酸的重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主中。

11.一種用于合成ATP的試劑盒，其包括如權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的重組表達(dá)宿主。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的試劑盒，其中，還包括以下中的一種或更多種：乙酰磷酸和/或其鹽、腺苷、鎂離子、用于起緩沖作用的陽(yáng)離子和陰離子、pH調(diào)節(jié)劑。