[發(fā)明專(zhuān)利]一種轉(zhuǎn)氨酶突變體及在制備西他列汀中間體中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810539604.1
• 申請(qǐng)日: 2018-05-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108866021B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭裕國(guó);程峰;柳志強(qiáng);何人寶;金逸中;湯曉玲;邵鴻鳴;張曉健;周?chē)?guó)斌;林嬌華;張峰;楊海龍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué);浙江永太科技股份有限公司;浙江永太藥業(yè)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/10
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/10;C12P13/00
• 代理公司: 杭州天正專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種轉(zhuǎn)氨酶突變體，其特征在于所述突變體是SEQ ID NO：2所示第45位的異亮氨酸取代為纈氨酸、第68位的甘氨酸取代為酪氨酸、第103位的異亮氨酸取代為亮氨酸、第128位的絲氨酸取代為丙氨酸、第157位的酪氨酸取代為絲氨酸、第327位的天冬氨酸取代為谷氨酸。

2.一種權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)氨酶突變體的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：3所示。

3.一種權(quán)利要求2所述轉(zhuǎn)氨酶突變體的編碼基因構(gòu)建的重組載體。

4.一種權(quán)利要求3所述重組載體轉(zhuǎn)化制備的重組基因工程菌。

5.一種權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)氨酶突變體在生物催化合成西他列汀中間體中的應(yīng)用。

6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以含有轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因的重組大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為生物催化劑，以[1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮]為底物，以二甲基亞砜為助溶劑、以磷酸吡哆醛為輔酶、以異丙胺為輔底物，以pH 8-9三乙醇胺緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在溫度30-45℃、攪拌速度100-250r/min的條件下進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮；所述反應(yīng)體系中，濕菌體用量為10-100g/L，底物終濃度為2～50g/L，二甲基亞砜體積終濃度為10-40％，磷酸吡哆醛0.5g/L，異丙胺10g/L。

7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述西他列汀中間體為西他列汀酯類(lèi)中間體。

8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為：以含有轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因的重組大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為生物催化劑，以潛手性羰基化合物為底物，以二甲基亞砜為助溶劑、以磷酸吡哆醛為輔酶、以異丙胺為輔底物，以pH 8-9三乙醇胺緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在溫度25-35℃、攪拌速度100-250r/min的條件下進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得西他列汀酯類(lèi)中間體；所述反應(yīng)體系中，濕菌體用量為10～100g/L，底物終濃度為2～60g/L，二甲基亞砜體積終濃度為10-40％，磷酸吡哆醛0.5g/L，異丙胺10g/L；所述底物為下列之一：3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸異丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸異丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯。

9.如權(quán)利要求6或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述分離純化方法為：反應(yīng)結(jié)束后，用濃鹽酸將反應(yīng)液pH調(diào)至1.5，加入硅藻土吸附細(xì)胞，攪拌20min，過(guò)濾，獲得濾液a和濾渣a，向?yàn)V渣a中加入1M鹽酸，攪拌20min，抽濾，獲得濾液b和濾渣b；合并濾液a和濾液b，用二氯甲烷萃取一次，獲得有機(jī)相a和水相a，有機(jī)相a用1M鹽酸萃取，獲得有機(jī)相b和水相b，合并水相a和水相b并用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至12，再用二氯甲烷萃取，獲得有機(jī)相c和水相c，水相c中再加入二氯甲烷萃取，獲得有機(jī)相d和水相d，合并有機(jī)相c和有機(jī)相d并用飽和氯化鈉水洗二次，加入無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾去除硫酸鈉，45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到西他列汀中間體或西他列汀酯類(lèi)中間體；所述硅藻土用量以反應(yīng)液體積計(jì)為0.18g/mL。

10.如權(quán)利要求6或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述濕菌體按如下方法制備：將含有轉(zhuǎn)氨酶突變體編碼基因的重組大腸桿菌接種至含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm下培養(yǎng)12h，再以體積濃度1％接種量接種至新鮮的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，150rpm下培養(yǎng)至菌體OD₆₀₀達(dá)0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后，4℃、5000rpm離心20min，棄去上清液，收集沉淀，即獲得所述的濕菌體。