[發(fā)明專利]一種轉(zhuǎn)氨酶突變體及在制備西他列汀中間體中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810539604.1
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108866021B
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭裕國;程峰;柳志強;何人寶;金逸中;湯曉玲;邵鴻鳴;張曉健;周國斌;林嬌華;張峰;楊海龍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué);浙江永太科技股份有限公司;浙江永太藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12P13/00
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種氨基轉(zhuǎn)移酶突變體及其制備西他列汀中間體的應(yīng)用，所述的應(yīng)用以含有氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的重組大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體作為生物催化劑，以西他列汀中間體前體酮為底物，以二甲基亞砜為助溶劑、以磷酸吡哆醛為輔酶、以異丙胺為輔底物，以pH 8?9三乙醇胺緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在溫度30?45℃、攪拌速度100?250r/min的條件下進行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液分離純化，獲得西他列汀；本發(fā)明方法的總收率約81％，產(chǎn)物e.e.值達到99％。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是ω-轉(zhuǎn)氨酶及其突變體酶在制備光學(xué)純西他列汀中間體中的方法，包括轉(zhuǎn)氨酶、突變體、編碼基因、含有該基因的重組載體、該重組載體轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌和重組酶、以及應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

西他列汀(sitagliptin)是由美國Merck公司和Codexis公司研制和開發(fā)，是首個獲得FDA批準用于治療Ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制劑(2016年10月)。DPP-IV是一個以同型二聚體形式存在于細胞膜上的多功能酶，它可以裂解包括胰高血糖素樣肽-1和抑胃肽在內(nèi)的多種肽類激素，而這兩者與II型糖尿病有著密切聯(lián)系。DPP-IV抑制劑通過抑制DPP-IV減少GLP-1的降解，增加GLP-1的血漿濃度，從而改善餐后血糖。此外，DPP-IV抑制劑還可抑制GIP、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽和胃泌素釋放肽等參與調(diào)節(jié)血糖的其他肽類的降解。西他列汀能夠血糖依賴性地增加胰島素的分泌，降糖作用較為適中，不會引發(fā)低血糖的發(fā)生，并且無增加體重、惡心、嘔吐等副作用。西他列汀的商品名為捷諾維(Januvia)，目前已在全世界70多個國家批準使用，近年來銷售額都在40億美元左右(2016年與二甲雙胍聯(lián)合銷售合計61億美元)，是國際上藥物銷售額前20強的藥物。

西他列汀及其中間體的合成既有完全化學(xué)法合成，也有化學(xué)法與酶法相結(jié)合的。對于化學(xué)-酶法而言關(guān)鍵就是要獲得一種ω-轉(zhuǎn)氨酶，其能夠催化不對稱轉(zhuǎn)氨反應(yīng)得到光學(xué)純的西他列汀中間體。

美國專利US6699871公開了一種西他列汀中間體的化學(xué)合成方法，采用手性源來誘導(dǎo)出手性的alpha-氨基酸，而后通過重氮化反應(yīng)產(chǎn)生beta-氨基酸來構(gòu)建所需的手性中心。該路線所需的原料成本相對較高，反應(yīng)較為麻煩，且產(chǎn)業(yè)化過程中工藝過程和產(chǎn)品質(zhì)量都難以控制。

國際專利W02005003135公開了以S-苯甘氨酰胺來誘導(dǎo)催化氫化而合成手性胺的合成方法(默克公司)。該路線需要兩次催化氫化，第一次所用的鉑催化劑價格昂貴，第二次脫保護時需要用大量的Pd(OH)₂-C催化劑，成本較高，e.e.值為96％，需要進一步重結(jié)晶。

國際專利W02004087650公開了默克公司關(guān)于西他列汀中間體的合成路線，利用手性釕催化劑對酮進行不對稱氫化構(gòu)建手性醇，然后將手性醇轉(zhuǎn)化成手性胺。該合成方法中，需要用到釕催化的不對稱氫化，催化劑價格昂貴，總收率只有52％，工藝中用到高壓氫氣，立體選擇性也不高。

國際專利W02007050485公開了默克公司關(guān)于西他列汀中間體的合成方法，采用了手性鍺催化劑對烯胺的不對稱氫化來合成手性胺，產(chǎn)率達到84％，e.e.值94％，但該方法需要用昂貴的鍺手性催化劑，去除與回收也較為困難。

美國專利US8293507公開了Codexis公司對節(jié)桿菌來源的轉(zhuǎn)氨酶(ATA117)進行改造得到的生物催化劑代替上述工藝中的鍺催化劑，轉(zhuǎn)氨得到的產(chǎn)物ee值達到99％。

以下專利對于合成西他列汀中間體的生產(chǎn)方法，公開了工藝路線。

中國專利CN102838511公開了浙江海翔藥業(yè)關(guān)于西他列汀中間體的生產(chǎn)方法，采用格式試劑對手性環(huán)氧氯丙烷進行親核取代，而后用氰化物進行取代水解合成beta-羥基酸，該方法總收率僅40％，而且采用劇毒氰化物，應(yīng)用受限。

中國專利CN102485718公開了浙江海翔藥業(yè)關(guān)于西他列汀中間體合成的路線，通過采用甲硫氨酸作為手性源進行合成，但是產(chǎn)率僅14％。