[發明專利]一種香豆素半抗原與抗原的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201810538377.0
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108840848B
• 公開（公告）日: 2021-11-23
• 發明（設計）人: 陳黎;劉惠民;崔華鵬;樊美娟;趙樂;潘立寧;王洪波;郭軍偉;秦亞瓊
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C07D311/12
• 分類號: C07D311/12;G01N33/577;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

一種香豆素半抗原與抗原的制備方法及應用，其特征在于：所述香豆素半抗原是由香豆素進行縮醛反應得到的；所述香豆素抗原是由香豆素半抗原與載體蛋白偶聯得到。本發明制備的抗原呈現出特異性的香豆素抗原決定簇，通過免疫動物可制備香豆素單克隆抗體。產生的抗體特異性高、靈敏度高，可用于制備檢測香豆素的酶聯免疫試劑盒、膠體金試紙條和時間分辨熒光免疫層析試紙條，從而實現煙草、香精香料及食品中香豆素的快速檢測。

技術領域

本發明涉及一種香豆素半抗原與抗原的制備方法及應用。屬于免疫化學技術領域。

背景技術

香豆素系化合物是一類具有芳香氣味，母核為苯并α-吡喃酮結構的天然產物，廣泛分布于植物界，根據結構可分為簡單香豆素系化合物、呋喃香豆素系化合物、吡喃香豆素系化合物和其他香豆素系化合物等。香豆素（coumarin）又名鄰羥基桂酸內酯和1,2-苯并吡喃酮，是一種天然植物次生產品，是廣泛存在于自然界中的一種內酯類化合物，于1820年發現于黑香豆中，主要以游離狀態和苷的形式存在于植物中，在蕓香科和傘形科植物中最多，其次存在于豆科、蘭科、木樨科、茄科和菊科植物，少數來自微生物。香豆素作為一種重要的香料，常用作定香劑、脫臭劑，配制香水和香料，也用作飲料、食品、卷煙、塑料制品、橡膠制品等的增香劑，醫藥上將其加入藥劑中作為矯味劑。實驗發現，香豆素對小鼠胚胎有毒性，能引起痛覺消失，使中性膽堿酯酶發生變化，對大鼠為可疑致腫瘤物。香豆素在體內的含量達到一定量時具有生理毒性，通過長期的動物實驗發現其具有肝毒性，主要是由代謝的途徑導致P450（細胞色素P）及其依賴性酶的減少引起的。美國食品藥品管理局（FDA）早在1954年就禁止將香豆素用作食品添加劑；歐洲食品安全局（EFSA）規定香豆素的每日耐受攝入量（TDI）為0.1 mg/kg bw；歐盟規定，對于洗去型化妝品，香豆素的含量不得超過30 μg/g，對于非洗去型化妝品，香豆素含量不得高于10 μg/g；2010年7月，臺灣地區食品管理機構發布通知禁止在食品中添加香豆素，同時規定“惟飲料中因使用天然香料，導致天然香料本身含香豆素殘留時，其含量仍應在2.0 mg/kg以下”。

目前，香豆素主要通過直接萃取法、超聲萃取法、同時蒸餾萃取法、水蒸氣蒸餾法等提取，結合氣相色譜法（GC）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）、高效液相色譜法（HPLC）、超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）檢測。但是由于這些分析方法需要昂貴的大型儀器設備和專業的檢測人員、前處理過程復雜、操作繁瑣、檢測成本高、分析速度慢，難以滿足現場監測和大量樣本中香豆素含量快速篩查的需要。基于抗原抗體特異性識別的免疫分析方法可以定性定量檢測樣品中的香豆素含量。這種分析方法對儀器設備要求不高、快速簡便，一般無需對樣品進行復雜的預處理，靈敏度高、特異性強，對使用人員的專業技術要求不高，容易普及和推廣，可滿足快速分析檢測的需要，尤其適宜現場篩選和大量樣品的快速分析。免疫分析為香豆素研究提供了一個新的分析檢測途徑。免疫分析目前已成為分析研究的一個嶄新領域，美國化學會將免疫分析與氣相色譜、液相色譜共同列為分析的三大支柱技術。本發明屬于小分子化合物免疫化學和殘留分析技術領域，涉及有機合成、免疫化學及生物化學等，依靠免疫學、免疫化學基本原理和生物技術手段，設計、合成小分子目標分析物半抗原，并與載體蛋白質偶聯，制備有效人工抗原。制備的抗原可以通過免疫動物制備對小分子分析物特異性識別的抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學反應和易被檢測識別的標記物的放大作用，定量的檢測樣品中超微量小分子目標物。半抗原的分子設計與合成是產生特異性抗體和建立免疫分析方法的關鍵步驟。人工抗原的制備，包括結合位點、結合方式、載體種類及半抗原與目標分析物質任何結構上的差異，諸如分子大小、形狀、成分、構型、構象、極性、電子云密度等在內的拓撲性征，都可能極大的影響著相應抗體的性質。目前關于香豆素半抗原及抗原的制備方法尚未見報道。

發明內容

本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而提供一種香豆素半抗原與抗原的制備方法及其應用。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：

一種香豆素半抗原的制備方法，是由香豆素進行縮醛反應得到的，其分子結構為：