[發(fā)明專利]辣椒輕斑駁病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重組系統(tǒng)及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810537608.6
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN110144364B
• 公開（公告）日: 2023-05-12
• 發(fā)明（設計）人: 彭杰軍;鄭紅英;趙晉平;錢靖;燕飛;魯宇文;林林;程曄;陳劍平
• 申請（專利權）人: 寧波大學;浙江省農業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;C12N15/66
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧

本發(fā)明涉及植物基因工程領域，具體涉及一種辣椒輕斑駁病毒侵染性克隆的Cre?LoxP重組系統(tǒng)及其應用。本發(fā)明提供了一種辣椒輕斑駁病毒PMMoV?GFP侵染性克隆的Cre?LoxP重組系統(tǒng)，其包括pJM23載體、pJG102載體和pCre載體。進一步通過采用將Cre基因與pJG102載體融合的方式，簡化Cre?LoxP重組系統(tǒng)載體數(shù)量，構建了由pJM23載體和pJG2303載體所組成的PMMoV?GFP侵染性克隆的Cre?LoxP重組系統(tǒng)。通過本發(fā)明所述的Cre?LoxP重組系統(tǒng)降低了對PMMoV全序列改造的難度，提高了PMMoV外源蛋白表達系統(tǒng)的可操作性。

技術領域

本發(fā)明涉及植物基因工程領域，具體涉及一種辣椒輕斑駁病毒侵染性克隆的Cre-LoxP重組系統(tǒng)及其應用。更具體地，涉及利用Cre-LoxP重組系統(tǒng)實現(xiàn)攜帶外源GFP基因的辣椒輕斑駁病毒侵染性克隆載體的重組。

背景技術

辣椒輕斑駁病毒(pepper?mild?mottle?virus,PMMoV)屬于煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)成員，病毒粒體呈直桿狀，為正單鏈RNA病毒，基因組由6357個核苷酸組成，共有4個開放閱讀框架(open?reading?frames,ORFs)，編碼4個蛋白，分別編碼病毒復制酶蛋白p126(70-3421nt)、病毒復制酶蛋白p183(70-4906nt)、運動蛋白MP(movementprotein,4909-5680nt)和外殼蛋白CP(coat?protein,5685-6156nt)。PMMoV是危害辣椒生產的重要病毒之一，植株被侵染后表現(xiàn)出斑駁或黃綠相間的花葉癥狀，果實被侵染后出現(xiàn)畸形、斑駁，引起辣椒落葉、落花、落果，在全世界范圍內嚴重威脅著辣椒的生產。

Cre重組酶是大腸桿菌P1噬菌體cre基因的38.5kDa產物，其能識別并催化LoxP位點間的重組。LoxP是一段長度為34bp的DNA序列，包括被8bp間隔的2個13bp的反向重復序列，每個反向重復及其臨近的4bp構成一個Cre蛋白結合區(qū)，其序列如下：ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。間隔的非對稱性決定了LoxP位點具有方向性。Cre重組酶不需要其他一些輔助因子即能特異性識別LoxP位點，完成活體內和體外細胞中的DNA重組。Cre介導的重組過程是一個動態(tài)、可逆的過程，根據(jù)LoxP位點位置可以分成三種情況：(1)如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列；(2)如果兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個LoxP位點間的序列倒位；(3)如果兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位。

通過在目的基因序列中引入LoxP序列，利用Cre酶誘導LoxP位點進行特異性整合或重組，以期實現(xiàn)更簡單、更有效地對目的基因組進行遺傳修飾和改造，促進對基因功能的研究。

發(fā)明內容

本發(fā)明將攜帶外源GFP基因的辣椒輕斑駁病毒(Pepper?mild?mottle?virus，PMMoV)侵染性克隆載體拆分為約4kb和2kb載體，在相應目的片段引入LoxP序列，利用Cre酶誘導LoxP位點在植物體內重組形成完整的PMMoV-GFP病毒序列，從而產生具有侵染活性的PMMoV-GFP病毒粒子。

本發(fā)明的目的之一是提供一種辣椒輕斑駁病毒PMMoV-GFP侵染性克隆的Cre-LoxP重組系統(tǒng)。

在一些優(yōu)選方式中，所述Cre-LoxP重組系統(tǒng)包括pJM23載體、pJG102載體和pCre載體。