[發明專利]一株產核酸釀酒酵母工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201810537366.0
• 申請日: 2018-05-30
• 公開（公告）號: CN108660085B
• 公開（公告）日: 2020-10-20
• 發明（設計）人: 郭學武;倪曉豐;王東旭;肖冬光;陳葉福;趙賓
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P19/34;C12R1/865
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一株釀酒酵母工程菌在產核酸中的用途，其特征在于：所述工程菌是通過基因工程手段過表達液泡蛋白分選受體基因PEP1得到，所述PEP1基因序列如SEQ ID NO.1所示；所述工程菌是通過構建強啟動子與液泡蛋白分選受體基因PEP1以及篩選標記基因的連接片段，通過同源重組的方法，將連接片段以rDNA非轉錄間隔區域1作為插入位點整合到宿主菌釀酒酵母的基因中，從而獲得重組工程菌；所述強啟動子為PGK1。

2.如權利要求1所述的一株釀酒酵母工程菌在產核酸中的用途，其特征在于，所述篩選標記基因為Kan基因。

3.如權利要求1所述的一株釀酒酵母工程菌在產核酸中的用途，其特征在于，所述宿主菌為釀酒酵母W303a。

4.如權利要求1所述的一株釀酒酵母工程菌在產核酸中的用途，其特征在于：所述工程菌的構建方法如下：

（1）將強啟動子PGK1連接到載體質粒Yep352上，得到重組質粒Yep352-PGK1；

（2）以釀酒酵母W303a的總DNA基因組為模板，PCR 擴增，得到 PEP1基因片段 ，將PEP1基因片段連接到重組質粒Yep352-PGK1上，得到重組質粒 Yep352-PGK1- PEP1；

（3）以重組質粒 Yep352-PGK1-PEP1為模板經PCR擴增，得到PGK1-PEP1連接片段；

（4）以釀酒酵母菌株W303a基因組為模板PCR得到插入位點rDNA非轉錄間隔區域1的上游同源臂和下游同源臂；

（5）以質粒PUC6為模板PCR得到篩選標記基因Kan片段；

（6）將步驟（3）（4）（5）得到的上游同源臂、Kan片段、PGK1-PEP1連接片段、下游同源臂片段通過醋酸鋰轉化法轉化到宿主釀酒酵母菌株W303a中，篩選得到多拷貝表達PEP1基因的工程菌。

5.如權利要求1所述的一株釀酒酵母工程菌在產核酸中的用途，其特征在于：所述工程菌的培養方法如下：

種子液培養：將菌泥從斜面上挑取一環，將釀酒酵母工程菌接種到YPD培養基試管中，28-30℃、180-190 rpm條件下培養10-12 h，得到種子液；

發酵培養：將種子液按照接種量3-5%接種于YPD液體培養基中，28-30℃、180-190 rpm條件下發酵培養4h。