[發明專利]嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法

有效

• 申請號: 201810536705.3
• 申請日: 2018-06-01
• 公開（公告）號: CN108715828B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 劉玉蘭;康萍;秦琴;王樹輝
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 胡海國

本發明公開一種嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，包括以下步驟：配制細胞培養液；將豬小腸上皮細胞接種至細胞培養液中培養，獲得待誘導細胞；向待誘導細胞中加入含有嘔吐毒素的細胞培養液，進行嘔吐毒素誘導，獲得經過嘔吐毒素誘導處理后的誘導處理細胞；測定所述誘導處理細胞的細胞活力、乳酸脫氫酶活力、claudin?1蛋白表達以及程序性壞死關鍵基因的mRNA表達及其蛋白表達，判斷嘔吐毒素誘導對豬小腸上皮細胞程序性壞死的作用。本發明以嘔吐毒素為誘導劑，成功建立豬小腸上皮細胞程序性壞死模型，具有操作簡便、結果可靠、重復性好的優點。

技術領域

本發明涉及細胞模型構建技術領域，特別涉及一種嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法。

背景技術

細胞程序性壞死是一種由死亡受體介導的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)非依賴性細胞死亡模式，通常在凋亡被抑制的情況下發生，死亡細胞具有明顯的壞死特征。研究表明，細胞程序性壞死在缺血再灌注和炎癥反應等多種因素導致的組織(如肝臟)損傷或壞死中發揮重要作用，有效抑制細胞程序性壞死對這些因素誘導的組織損傷或壞死具有重要的預防和治療作用。腸道是機體營養物質消化吸收的重要場所，也是機體最大的免疫器官，在機體抵御病原微生物的入侵中發揮著重要作用，因此，建立腸細胞程序性壞死模型，對于研究腸道損傷機制和腸道疾病治療具有十分重要的意義。

目前常用于誘導細胞程序性壞死的誘導劑包括融合蛋白、病毒轉染系統和黍子籽粒蛋白，但是其中涉及復雜的誘導劑制備過程，包括構建載體、轉染、誘導等許多步驟，以及涉及脫鹽、陽離子交換層析和凝膠層析等繁瑣步驟獲得純化蛋白的制備過程，因此，利用此類誘導劑構建細胞程序性壞死模型存在步驟繁瑣或效果不穩定的缺點。

發明內容

本發明的主要目的是提出一種嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，旨在使豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的構建操作簡便且效果穩定可靠。

為實現上述目的，本發明提出一種嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，包括以下步驟：

配制細胞培養液；

將豬小腸上皮細胞接種至所述細胞培養液中培養，獲得待誘導細胞；

向所述待誘導細胞中加入含有嘔吐毒素的所述細胞培養液，進行嘔吐毒素誘導，獲得經過嘔吐毒素誘導處理后的誘導處理細胞；

測定所述誘導處理細胞的細胞活力、乳酸脫氫酶活力、claudin-1蛋白表達以及程序性壞死關鍵基因的mRNA表達及其蛋白表達，判斷嘔吐毒素誘導對豬小腸上皮細胞程序性壞死的作用。

優選地，配制細胞培養液的步驟，具體包括：

向DMEM/F-12培養基中加入5％的胎牛血清、1％的青鏈霉素混合液、1％的谷氨酰胺、0.1％的轉鐵蛋白以及5μg/L的表皮細胞生長因子，混合后制得細胞培養液。

優選地，將豬小腸上皮細胞接種至所述細胞培養液中培養后，獲得待誘導細胞的步驟，包括：

將豬小腸上皮細胞接種至含有所述細胞培養液的培養板或培養皿中，置于培養箱中培養至細胞匯合率達到70～80％，得培養細胞；

對所述培養細胞進行傳代培養至細胞傳代至2～3代，獲得待誘導細胞。

優選地，將豬小腸上皮細胞接種至含有所述細胞培養液的培養板或培養皿中，置于培養箱中培養至細胞匯合率達到70～80％，得培養細胞的步驟，具體包括：

取凍存的豬小腸上皮細胞在37℃水浴中復蘇后，按3～4×10⁵個/mL的接種量接種至含有細胞培養液的培養板或培養皿中，置于培養箱中培養至細胞匯合率達到70～80％，得培養細胞，其中，所述培養箱的培養條件設置為：CO₂的體積濃度為5％、培養溫度為37℃、培養時長為2～3天，每隔20～26h更換一次細胞培養液。