[發明專利]嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法

有效

• 申請號: 201810536705.3
• 申請日: 2018-06-01
• 公開（公告）號: CN108715828B
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 劉玉蘭;康萍;秦琴;王樹輝
• 申請（專利權）人: 武漢輕工大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 深圳市世紀恒程知識產權代理事務所 44287
• 代理人: 胡海國

1.一種嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，其特征在于，包括以下步驟：

配制細胞培養液；

將豬小腸上皮細胞接種至所述細胞培養液中培養，獲得待誘導細胞；

向所述待誘導細胞中加入含有嘔吐毒素的所述細胞培養液，進行嘔吐毒素誘導，獲得經過嘔吐毒素誘導處理后的誘導處理細胞；

測定所述誘導處理細胞的細胞活力、乳酸脫氫酶活力、claudin-1蛋白表達以及程序性壞死關鍵基因的mRNA表達及其蛋白表達，判斷嘔吐毒素誘導對豬小腸上皮細胞程序性壞死的作用；

其中，測定所述誘導處理細胞的細胞活力、乳酸脫氫酶活力、claudin-1蛋白表達、以及程序性壞死關鍵基因的mRNA表達及其蛋白表達，判斷嘔吐毒素誘導對豬小腸上皮細胞程序性壞死的作用的步驟中：

所述程序性壞死關鍵基因包括受體相互作用蛋白1、受體相互作用蛋白3和磷酸化混合系列蛋白激酶結構域樣蛋白；

所述豬小腸上皮細胞為IPEC-1；

向所述待誘導細胞中加入含有嘔吐毒素的所述細胞培養液，進行嘔吐毒素誘導，獲得經過嘔吐毒素誘導處理后的誘導處理細胞的步驟中：所述含有嘔吐毒素的所述細胞培養液中，嘔吐毒素的濃度為0.5μg/mL，誘導時長為48h。

2.如權利要求1所述的嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，其特征在于，配制細胞培養液的步驟，具體包括：

向DMEM/F-12培養基中加入5%的胎牛血清、1%的青鏈霉素混合液、1%的谷氨酰胺、0.1%的轉鐵蛋白以及5μg/L的表皮細胞生長因子，混合后制得細胞培養液。

3.如權利要求2所述的嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，其特征在于，將豬小腸上皮細胞接種至所述細胞培養液中培養后，獲得待誘導細胞的步驟，包括：

將豬小腸上皮細胞接種至含有所述細胞培養液的培養板或培養皿中，置于培養箱中培養至細胞匯合率達到70~80%，得培養細胞；

對所述培養細胞進行傳代培養至細胞傳代至2~3代，獲得待誘導細胞。

4.如權利要求3所述的嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，其特征在于，將豬小腸上皮細胞接種至含有所述細胞培養液的培養板或培養皿中，置于培養箱中培養至細胞匯合率達到70~80%，得培養細胞的步驟，具體包括：

取凍存的豬小腸上皮細胞在37℃水浴中復蘇后，按3~4×10⁵個/mL的接種量接種至含有細胞培養液的培養板或培養皿中，置于培養箱中培養至細胞匯合率達到70~80%，得培養細胞，其中，所述培養箱的培養條件設置為：CO₂的體積濃度為5%、培養溫度為37℃、培養時長為2~3天，每隔20~26h更換一次細胞培養液。

5.如權利要求3所述的嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，其特征在于，對所述培養細胞進行傳代培養至細胞傳代至2~3代，獲得待誘導細胞的步驟中：所述傳代培養的培養時間為7~8天。

6.如權利要求1所述的嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，其特征在于，向所述待誘導細胞中加入含有嘔吐毒素的所述細胞培養液，進行嘔吐毒素誘導，獲得經過嘔吐毒素誘導處理后的誘導處理細胞的步驟，具體包括：

將所述待誘導細胞接種至孔板中，加入所述細胞培養液進行培養至細胞貼壁且長到70~80%后，再向孔板中加入含有嘔吐毒素的所述細胞培養液，進行嘔吐毒素誘導，獲得經過嘔吐毒素誘導處理后的誘導處理細胞。

7.如權利要求6所述的嘔吐毒素誘導豬小腸上皮細胞程序性壞死模型的建立方法，其特征在于，將所述待誘導細胞接種至孔板中，加入所述細胞培養液進行培養的步驟中：所述待誘導細胞接種至所述孔板中的接種量為3~4×10⁴個/mL，所述細胞培養液在所述孔板中的添加量為80~120μL/孔。