[發明專利]棉花遺傳轉化中產生正常苗的培養基及方法

有效

• 申請號: 201810532108.3
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN110521590B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 羅曉麗;肖娟麗;張安紅;王志安;劉傳亮;馬丹;孫瑞斌;劉志紅;王少輝
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院棉花研究所;山西省農業科學院棉花研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

本發明公開了棉花遺傳轉化中產生正常苗的培養基及方法，通過使用無激素的增殖培養基對誘導篩選培養后的愈傷組織進行增殖培養，縮短胚性愈傷組織繼代培養時間，增加胚性愈傷組織繼代培養透氣性，提高分化培養基固化劑含量，胚狀體形成后降低培養基中糖含量，進而保證正常苗的產生率達90％以上。

技術領域

本發明涉及技術領域，更具體的說是涉及棉花遺傳轉化中產生正常苗的培養基及方法。

背景技術

棉花是一種重要的經濟作物，然而其種植過程中容易遭受嚴重病蟲害，進而使得每年皮棉產量損失達總產的10％-20％。

隨著生物工程技術的發展，研究人員將許多有益的農藝性狀、抗病蟲和抗逆等性狀轉化到棉花中，以提高其產量和品質，增加抗蟲性、抗病性、抗除草劑和抗逆性，從而提高棉花的種植效率，降低成本，并減輕環境污染。農桿菌介導轉化法可以高效地將外源基因整合到棉花基因組中，而外源基因的穩定遺傳和高效表達必須以組織培養為基礎。棉花體細胞胚發生和再生過程中常伴隨著大量的畸形胚和畸形苗，尤其常出現組培苗玻璃化、半玻璃化的現象，這些問題已經成為棉花遺傳轉化、棉花功能基因的驗證和棉花相關基因克隆等研究領域的障礙和瓶頸。

因此，如何減少棉花遺傳轉化過程中畸形苗的產生是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了棉花遺傳轉化中產生正常苗的培養基及方法，通過本發明培養基及培養方法，可使正常苗的發生率達90％以上。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

棉花遺傳轉化中產生正常苗的培養基，所述培養基包括增殖培養基，所述增殖培養基包括如下組分：維生素B18-12mg/L，葡萄糖28-32g/L，Phytagel2.8-3.0g/L和無機鹽，pH 6.8；其中，所述無機鹽為MS培養基中的無機鹽，并且無機鹽中的硝酸鉀濃度加倍。

優選地，所述培養基還包括分化培養基，所述分化培養基以所述增殖培養基為基礎，去掉無機鹽中的硝酸銨成分，添加天冬素0.45-0.55g/L，谷氨酰銨0.8-1.2g/L，并且Phytagel濃度為3.5-3.9g/L，葡萄糖濃度為20-25g/L。

優選地，所述培養基還包括成苗培養基，所述成苗培養基以所述分化培養基為基礎，并且Phytagel濃度為3.2-3.3g/L，葡萄糖濃度為15-25g/L。

棉花遺傳轉化中產生正常苗的培養方法，包括以下方法的任意一種或幾種：

(1)使用無激素的增殖培養基對誘導篩選培養后的愈傷組織進行增殖培養。

(2)縮短胚性愈傷組織繼代培養時間。

(3)增加胚性愈傷組織繼代培養透氣性。

(4)提高分化培養基固化劑含量。

(5)胚狀體形成后降低培養基中糖含量。

二次誘導篩選培養后，將愈傷組織轉入增殖培養基時即時抽掉激素可減少畸形苗的數量。胚性愈傷組織在分化培養基上繼代培養時間過長會出現愈傷組織褐化死亡和后期畸形苗增加的現象，因此，對胚性愈傷組織繼代培養時間進行調整，縮短胚性愈傷組織從體細胞成熟到出苗的時間，可減少褐化死亡和畸形苗的發生。此外，胚性愈傷組織繼代培養過程中增加透氣性、提高分化培養基固化劑含量，胚狀體形成后降低培養基中糖含量均可減少玻璃化、半玻璃化畸形苗的產生。

棉花遺傳轉化中產生正常苗的培養方法，包括以下步驟：

S1.培育無菌苗，取無菌苗下胚軸切段；

S2.制備浸染液；

S3.使用浸染液侵染下胚軸切段，進行共培養；