[發明專利]西瓜枯萎病菌RNAi組份FonDCL1基因缺失突變體及其構建方法

有效

• 申請號: 201810526655.0
• 申請日: 2018-05-29
• 公開（公告）號: CN108728369B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 曾凡云;彭軍;漆艷香;丁兆健;謝藝賢;張欣
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/55;C12N9/16;C12R1/77
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

本發明公開了一種西瓜枯萎病菌RNAi組份FonDCL1基因缺失突變體及其構建方法。本發明根據已有報道的Dicer like 1蛋白序列，同源比對Fon基因組序列，獲得西瓜枯萎病菌FonDCL1基因，采用基因同源置換原理，利用Split?marker策略，用潮霉素B(HPH)基因DNA片段替換目的基因FonDCL1，通過構建該基因同源重組片段，以野生菌株Fon1遺傳轉化獲得FonDCL1的基因缺失突變體，該FonDCL1突變體具有對西瓜幼苗致病力增強，對莫能霉素鈉、羥基脲、熒光增白劑CFW、剛果紅CR及雙氧水等非生物脅迫因子更加敏感等特性，這為Fon1參與自身生長發育及侵染西瓜過程中產生的小RNA的功能解析提供研究基礎。

技術領域

本發明涉及一種西瓜枯萎病菌RNAi組份FonDCL1基因缺失突變體及其構建方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術

西瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起的西瓜維管束系統病害，病原主要通過根部傷口或根毛頂端細胞間隙侵入，在寄主管壁細胞間和細胞內生長后，進入維管束，分解破壞細胞，使導管內積累果膠類物質，堵塞導管，影響水分運輸，進而引起植株萎蔫。

西瓜枯萎病自幼苗至成株均可發病，以座瓜期和瓜膨大后期發病最重。幼苗受害，出苗前可造成爛種出土后發病，子葉、真葉呈失水狀萎蔫，莖基部變褐收縮呈碎倒狀，拔出苗子可見根部黃褐色腐爛。成株期受害，初期病株下部葉片失水萎蔫，莖蔓基部向上褪綠。后期病部呈棕褐色，發軟，常縱裂，有膠狀紅色物質溢出。病株基部潮濕時，布滿白色至粉紅色霉狀病原分生孢子，剖視莖基部至根部，可見維管束變黃褐色。

迄今，己發現西瓜枯萎病有個生理小種，即生理小種0、1、2和3，中國以生理小種1占優勢。在農業生產中，枯萎病型尖孢鐮刀菌除危害西瓜外，寄主范圍廣泛，可引起100多種植物維管束萎蔫病害，如川紅花、甘蔗、芝麻、粉蕉、鳳梨以及瓜類和豆類等多種植物，尤其對葫蘆科植物、香蕉、番茄和棉花等高經濟價值作物有嚴重危害作用。

西瓜枯萎病在我國各地西瓜栽培區均有發生，該病害可造成西瓜產量下降，甚至絕收。近年來西瓜栽培尤其是保護地面積迅速擴大，重茬連作面積增大，保護地高溫高濕造成西瓜枯萎病越來越普遍，越來越嚴重，給西瓜產業造成巨大經濟損失。

miRNA(microRNA)是一類長約22nt，具有調控功能的內源性非編碼小RNA。miRNA參與機體中許多重要的生理及病理過程，如機體的生長發育、腫瘤的發生和免疫反應等，這使得其成為了生物學研究的焦點。Dicer蛋白是RNaseⅢ家族中重要的一員，對miRNA或siRNA的產生起著至關重要的作用。Dicer蛋白通常由1個DEXH盒子或H盒子、1個DUF283結構域、1個PAZ結構域、2個RNaseⅢ結構域(RNaseⅢa和RNaseⅢb)和1個dsRNA結合結構域組成。Dicer蛋白的分子結構決定了其在miRNAs合成中發揮著重要作用。

Dicer可以將pre-miRNA降解成特定長度，通常為21-25nt的短dsRNA片段。Dicer首先將pre-miRNA的3’端二核苷酸與其自身的PAZ結構域結合，然后利用“分子標尺”的結構在pre-miRNA固定位置進行切割，形成miRNA的5’端，Dicer對pre-miRNA的作用過程需要Mg²⁺，但又不結合Mg²⁺，其催化活性對離子強度敏感表明靜電底物-酶相互作用對Dicer的功能是非常重要的。

在擬南芥中，在受到病毒侵染時，DCL4是擬南芥中Dicer抵抗病毒的第一道防線，DCL4可以產生小RNA抵御病毒。在DCL4不能發揮抵御活性時，DCL2就可以成為Dicer抵抗病毒的第二道防線。在水稻的Osdcl1的缺失突變體中，miRNA的數量會大量的減少，會最終影響水稻的發育，表明OsDcr1與水稻miRNA的加工過程有關，通過miRNA來調控水稻的生長發育。在果蠅中DCL1與miRNA的切割和miRISC復合物的產生有關。