[發明專利]西瓜枯萎病菌RNAi組份FonDCL1基因缺失突變體及其構建方法

有效

• 申請號: 201810526655.0
• 申請日: 2018-05-29
• 公開（公告）號: CN108728369B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 曾凡云;彭軍;漆艷香;丁兆健;謝藝賢;張欣
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/55;C12N9/16;C12R1/77
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

1.一種西瓜枯萎病菌RNAi組份基因FonDCL1，其特征在于，包含其上、下游核苷酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根據權利要求1所述的一種西瓜枯萎病菌RNAi組份基因FonDCL1，其特征在于，所述上、下游核苷酸序列的長度均為3Kb。

3.根據權利要求1所述的一種西瓜枯萎病菌RNAi組份基因FonDCL1，其特征在于，與潮霉素抗性基因HPH發生替換的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.權利要求1或2所述西瓜枯萎病菌RNAi組份基因FonDCL1編碼的cDNA，其特征在于，其具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。

5.權利要求1或2所述西瓜枯萎病菌RNAi組份基因FonDCL1表達的蛋白質，其特征在于，其具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

6.一種西瓜枯萎病菌FonDCL1基因缺失突變體，其特征在于，通過以下方法獲得：

1)FonDCL1基因缺失重組DNA片段構建

第一輪PCR擴增：以西瓜枯萎病基因組DNA為模板，引物Fon1DCL1-LBCK/Fon1DCL1-HPH-LB-R擴增FonDCL1基因上游FonDCL1-UP片段，引物Fon1DCL1-HPH-RB-F/Fon1DCL1-RBCK擴增FonDCL1基因下游FonDCL1-DOWN片段；以載體pCT74質粒DNA為模板，引物HYG-F/HYG-R擴增抗性基因HYG片段；

第二輪PCR擴增：以FonDCL1-UP和HYG為模板，引物Fon1DCL1-LB-F/HYG-R1擴增FonDCL1-UP+HY片段，以FonDCL1-DOWN和HYG為模板，引物HYG-F1/Fon1DCL1-RB-R擴增YG+FonDCL1-DOWN片段；

2)將原生質體與FonDCL1-UP+HY片段和YG+FonDCL1-DOWN片段混勻，進行FonDCL1基因缺失遺傳轉化，獲得突變體；

所述引物Fon1DCL1-LBCK、Fon1DCL1-HPH-LB-R、Fon1DCL1-HPH-RB-F、Fon1DCL1-RBCK、HYG-F、HYG-R、Fon1DCL1-LB-F、HYG-R1、HYG-F1、Fon1DCL1-RB-R的核苷酸序列依次如SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14所示。

7.根據權利要求6所述的一種西瓜枯萎病菌FonDCL1基因缺失突變體，其特征在于，所述FonDCL1基因缺失突變體通過以下方法鑒定：

以轉化子的基因組DNA為模板，設計四對引物用于鑒定FonDCL1基因缺失突變體，分別是上游引物Fon1DCL1-LBCK/HPT-LBCK，下游引物Fon1DCL1-RBCK/HPT-RBCK，用于擴增HYG基因的引物HYG-F/HYG-R，FonDCL1基因內部引物Fon1DCL1-2193/Fon1DCL1-3030；

所述引物HPT-LBCK、HPT-RBCK、Fon1DCL1-2193、Fon1DCL1-3030的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示。