[發明專利]斑馬魚notch3基因突變體的制備方法

有效

• 申請號: 201810525963.1
• 申請日: 2018-05-28
• 公開（公告）號: CN108753833B
• 公開（公告）日: 2021-12-03
• 發明（設計）人: 張慶華;岳倩文;季策;徐行;張秋月;李偉明
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12N15/90
• 分類號: C12N15/90;C12N15/113;A01K67/027
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

本發明公開了涉及一種斑馬魚notch3基因突變體的制備方法；包括如下步驟：確定notch3基因敲除的靶點位置；以pUC19?gRNA scaffold質粒為模板，使用引物T7?notch3?sfd、tracr rev進行PCR擴增；對PCR產物純化、體外轉錄獲得gRNA；將gRNA與Cas9蛋白導入斑馬魚胚胎一細胞期中，培養獲得穩定遺傳的notch3基因突變體。本發明利用CRISPR/Cas9技術，通過選擇獨特的一段打靶區，使得斑馬魚中的notch3基因被敲除，又不“誤傷”其他基因，形成Notch3敲除的斑馬魚；另外，本發明還公開了notch3基因缺失斑馬魚突變體的表型，對于研究Notch信號通路意義重大。

技術領域

本發明涉及一種斑馬魚突變體，具體涉及一種斑馬魚notch3基因突變體的制備方法。

背景技術

CRISPR/Cas系統最早是在細菌的適應性免疫系統內發現的，其主要功能是對抗入侵的病毒及外源DNA。1987年大阪大學(Osaka University)的研究人員在Escherichiacoli K12的堿性磷酸酶基因附近發現了成簇的規律間隔的短回文重復序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)和CRISPR相關基因(CRISPR-associated genes，Cas gene)，目前普遍認為有40％的細菌基因組具有這樣的結構。CRISPR技術是最新出現的第三代基因組編輯工具，它能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯。CRISPR/Cas9基因編輯技術源于一種微生物防御噬菌體DNA或外源質粒入侵的后天免疫系統。CRISPR/Cas系統的防御機制可以分為三個階段。第一個階段稱為間隔序列的獲得，間隔序列被識別并被整合到CRISPR基因座中兩個相鄰重復單元之間。第二階段被稱為CRISPR的表達，一個主要的轉錄本，被RNA聚合酶從CRISPR基因座轉錄而來。隨后，特異性的核酸內切酶將pre-crRNAs切割成小的CRISPR RNAs(crRNAs)。第三個階段稱為干擾或免疫，在crRNA和Cas蛋白形成的復合物中crRNA能識別堿基對，特別是具有完全(或幾乎完全)互補的外來DNA(或RNA)的區域。這樣便開始了Cas蛋白對特定位點的切割。從細菌到古細菌共有三種類型的CRISPR/Cas系統，分別是Type I、II、III，其中Type II的運用最多。Type II中包括標志性的Cas9蛋白，該蛋白主要促進crRNA的成熟，降解侵入的噬菌體DNA或者入侵的外源質粒。目前，CRISPR/Cas9技術已廣泛用魚小鼠、斑馬魚、果蠅、酵母、大米、小麥、細菌等各種生物上，實現了不同生物進化階段物種的基因編輯。

與鋅指核酸酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)和轉錄激活樣效應因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)等基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9技術有如下優勢：

1、Cas9不具有特異性，

2、gRNA體現需要敲除的基因的特異性，靶向精確，作用高效，脫靶率低，

3、廉價便捷，細胞毒性低，

4、CRISPR技術更易于操作，具有更強的可擴展性。

已有研究表明，人NOTCH3基因的突變引起CADASIL綜合征，是一種遺傳性小動脈疾病，位于19號染色體上的Notch3基因突變所致的遺傳性腦小血管疾病，表現為皮質下缺血事件，并導致進行性癡呆伴假性球麻痹。因為涉及病變的位置廣，故暫無法通過手術解決，且由于其為遺傳性病變，藥物治療效果也欠佳，目前只能通過對癥處理，但是病程進行性加重可能是難免的。目前臨床無很好的治療方法，該病已經被西醫判了死刑，只能通過藥物和適當保健改善生活質量。