[發明專利]斑馬魚notch3基因突變體的制備方法有效
| 申請號： | 201810525963.1 | 申請日： | 2018-05-28 |
| 公開（公告）號： | CN108753833B | 公開（公告）日： | 2021-12-03 |
| 發明（設計）人： | 張慶華;岳倩文;季策;徐行;張秋月;李偉明 | 申請（專利權）人： | 上海海洋大學 |
| 主分類號： | C12N15/90 | 分類號： | C12N15/90;C12N15/113;A01K67/027 |
| 代理公司： | 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227 | 代理人： | 曹莉 |
| 地址： | 201306 上*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 斑馬 notch3 基因 突變體 制備 方法 | ||
1.一種斑馬魚notch3基因突變體的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
S1、確定notch3基因敲除的靶點在斑馬魚notch3基因序列的第四個外顯子上；
S2、根據步驟S1確定的靶點序列設計擴增引物；所述靶點序列為如SEQ ID NO.2所示的序列；
S3、以pUC19-gRNA scaffold質粒為模板，使用引物T7-notch3-sfd、tracr rev進行PCR擴增；所述引物T7-notch3-sfd的序列為如SEQ ID NO.3所示的序列；所述引物tracr rev的序列為如SEQ ID NO.4所示的序列；
S4、對步驟S3的PCR產物進行純化，體外轉錄獲得gRNA；所述gRNA的序列為如SEQ IDNO.7所示的序列；
S5、將gRNA與Cas9蛋白導入斑馬魚中；
S6、培養獲得穩定遺傳的斑馬魚notch3基因突變體；具體包括如下步驟：
A1、對導入gRNA與Cas9蛋白的48hpf斑馬魚進行notch3基因敲除檢測，確定notch3 F0靶點突變效率；
A2、將notch3 F0基因檢測敲除成功的成魚與野生型斑馬魚外交，得到F1胚胎；經基因型鑒定獲得notch3 F1突變體斑馬魚；
A3、將相同突變的notch3 F1突變體斑馬魚內交，獲得notch3 F2突變體斑馬魚；
A4、鑒定為F2中notch3基因敲除的純合子即所述穩定遺傳的斑馬魚notch3基因突變體；
獲得的notch3-/-突變體有軀干彎曲的明顯表型，并且純合致死。
2.根據權利要求1所述的斑馬魚notch3基因突變體的制備方法，其特征在于，步驟S3中，pUC19-gRNA scaffold質粒模板序列為如SEQ ID NO.1所示的序列。
3.根據權利要求1所述的斑馬魚notch3基因突變體的制備方法，其特征在于，步驟S5中，將gRNA與Cas9蛋白導入斑馬魚具體為：將gRNA與Cas9蛋白混合，顯微注射到斑馬魚一細胞期胚胎中；其中，gRNA終濃度為100ng/μL，Cas9蛋白終濃度為800ng/μL。
4.根據權利要求1所述的斑馬魚notch3基因突變體的制備方法，其特征在于，步驟A1中，notch3基因敲除檢測采用的引物序列為如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。
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