[發明專利]一種重組質粒pET28a-Ag43、表面展示質粒、重組工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201810516761.0
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN108676808B
• 公開（公告）日: 2021-02-12
• 發明（設計）人: 敬科舉;朱先峰;郭燕藍;凌雪萍
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種重組質粒pET28a?Ag43、表面展示質粒、重組工程菌及其應用，屬于基因工程技術領域。所述重組質粒pET28a?Ag43，自轉運蛋白Ag43編碼基因插入到質粒pET28a的EcoRI和HindIII多克隆位點處；所述自轉運蛋白Ag43編碼基因具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。外源蛋白基因片段可以通過雙酶切方式快速連接至重組質粒的多克隆位點，構建重組工程菌，實現外源蛋白在細胞表面展示表達，不需要破壁釋放胞內蛋白酶，同時酶蛋白固定到細胞表面，方便酶蛋白的回收和重復利用。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種重組質粒pET28a-Ag43、表面展示質粒、重組工程菌及其應用。

背景技術

細胞表面展示技術是指通過錨定蛋白與外源蛋白融合表達，借助錨定蛋白可結合到細胞外膜的特性將自轉運蛋白攜帶到細胞的表面，一方面克服了因為細胞膜的阻隔而造成底物和酶蛋白無法接觸的困難，提高了底物與酶的反應效率，另一方面，細胞表面展示大大地簡化了酶蛋白純化和回收再利用的過程。因此，細胞表面展示可廣泛應用于構建蛋白質篩選文庫、抗體疫苗開發、全細胞催化和環境修復。

但由于目前沒有通用的可商業化的質粒使用，極大的限制了細胞表面展示技術在生產的應用。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種重組質粒pET28a-Ag43、表面展示質粒、重組工程菌及其應用，能夠使外源蛋白在工程菌表面展示且具有高效的表達率。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

一種重組質粒pET28a-Ag43，自轉運蛋白Ag43編碼基因插入到質粒pET28a的EcoRI和HindIII多克隆位點處；

所述自轉運蛋白Ag43編碼基因具有序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本發明提供了一種上述方案所述重組質粒的制備方法，包括如下步驟：

1)采用EcoRI和HindIII分別對質粒pET28a和Ag43編碼基因進行雙酶切，得到酶切后的pET28a和酶切后的Ag43編碼基因；

2)將所述步驟1)的酶切后的pET28a和酶切后的Ag43編碼基因連接，得到重組質粒pET28a-Ag43。

優選的，所述步驟1)中Ag43編碼基因的制備方法包括如下步驟：

a.將大腸桿菌K-12 MG1655進行擴大培養，得到大腸桿菌K-12 MG1655菌體；

b.提取所述步驟a的大腸桿菌K-12 MG1655的總DNA；

c.以所述步驟b中大腸桿菌K-12 MG1655的總DNA為模板，采用引物Ag43-EcoRI-F和Ag43 -HindIII-R擴增Ag43編碼基因，得到Ag43編碼基因；

所述引物Ag43-EcoRI-F具有序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述引物Ag43 -HindIII-R具有序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

優選的，所述步驟c中Ag43-EcoRI-F和Ag43 -HindIII-R擴增的體系為：基因組DNA或者質粒DNA10～100ng，前端引物2～3μL，后端引物2～3μL，dNTP混合物1～3μL，10×ExTaq緩沖液5μL，Ex Taq聚合酶0.5μL，總體系為50μL；

所述前端引物的濃度為10μmol/L；所述后端引物的濃度為10μmol/L；所述dNTP混合物的濃度為10μmol/L。