[發(fā)明專利]一種基于RPA技術(shù)的石渠棘球絳蟲檢測試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810516496.6
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN110527730B
• 公開（公告）日: 2022-06-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賈萬忠;吳燕濤;閆鴻斌;李立;朱國強;李雙男;姚剛;田文俊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;陳曉慶

本發(fā)明公開了一種基于RPA技術(shù)的石渠棘球絳蟲檢測試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)石渠棘球絳蟲線粒體基因序列設(shè)計并篩選了一套可用于RPA檢測的引物及探針組合，建立了石渠棘球絳蟲特異性實時熒光RPA檢測方法。該方法采用重組酶和單鏈結(jié)合蛋白在常溫下協(xié)同實現(xiàn)引物與模板的特異性結(jié)合，在DNA聚合酶的作用下延伸引物生成新的DNA鏈。本發(fā)明的石渠棘球絳蟲特異性熒光RPA檢測方法操作簡便、快速、特異性強，適用于現(xiàn)場快速檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于RPA技術(shù)的石渠棘球絳蟲檢測試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

石渠棘球絳蟲(Echinococcus shiquicus)是2005年在中國四川省甘孜藏族自治州的石渠縣(北緯32°19’～34°20’，東經(jīng)97°20’～99°15’)被首次發(fā)現(xiàn)和命名的，并且被鑒定為一獨立種，屬于棘球?qū)?Echinococcus)絳蟲成員之一。棘球?qū)俳{蟲在生物分類學(xué)上屬于動物界(Animalia)、扁形動物門(Platyhelminthes)、絳蟲綱(Cestoda)、圓葉目(Cyclophyllidea)、帶科(Taeniidae)。棘球?qū)俳{蟲的分類一直備受爭議，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和深入，不同的分類方法和標(biāo)準(zhǔn)被提出，現(xiàn)正在趨于統(tǒng)一，棘球?qū)俳{蟲現(xiàn)公認有9個種，分別是細粒棘球絳蟲狹義種(E.granulosus s.s.)、多房棘球絳蟲(E.multilocularis)、伏氏棘球絳蟲(E.vogeli)、少節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthra)、石渠棘球絳蟲、獅棘球絳蟲(E.felidis)、馬棘球絳蟲(E.equinus)、奧氏棘球絳蟲(E.ortleppi)和加拿大棘球絳蟲(E.canadensis)，在中國呈流行性分布的種主要是細粒棘球絳蟲狹義種、多房棘球絳蟲和石渠棘球絳蟲。棘球?qū)俳{蟲的幼蟲，尤其是細粒棘球蚴和多房棘球蚴分別能夠引起中間宿主(包括人)的囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis，CE)和泡型棘球蚴病(alverolar echinococcosis，AE)，不但嚴(yán)重阻礙全球畜牧業(yè)的發(fā)展，而且嚴(yán)重威脅到人類的身體健康，是一種嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病，也是部分國家(包括我國)的重大公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)估計，對人類健康造成的危害：泡型棘球蚴病和囊型棘球蚴病每年分別可造成每人5.8和0.81的傷殘調(diào)整生命年(DALYs)的損失，人類對棘球蚴病的經(jīng)濟負擔(dān)每年可達1億DALYs(約7.64億美元)；對畜牧業(yè)造成的危害：每年全世界畜牧生產(chǎn)因棘球蚴病帶來的損失可能高達30億美元。石渠棘球絳蟲是我國流行的一種棘球絳蟲，并且與多房棘球絳蟲有諸多方面的相似性，所以對石渠棘球絳蟲(蚴)種鑒定的研究對控制石渠棘球蚴病有著重要的指導(dǎo)意義。

多年來，國內(nèi)外對于石渠棘球絳蟲的診斷方法主要包括剖檢法和分子生物學(xué)檢測方法，其中分子生物學(xué)檢測方法主要包括普通PCR、多重PCR、巢式PCR、PCR-RFLP、以及環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)等。盡管上述實驗方法特異性和靈敏度都很高，但是它們操作復(fù)雜，需要PCR等專業(yè)儀器設(shè)備，耗時長且需要訓(xùn)練有素的專業(yè)人員，有些方法還特別容易出現(xiàn)假陽性(LAMP)，因此這些方法的使用有諸多限制。

RPA技術(shù)是由以英國劍橋Babraham研究院建立的并由Twist Dx生物技術(shù)公司發(fā)明的(http://www.twistdx.co.uk/)。該技術(shù)以T4噬菌體的核酸復(fù)制機制為原理，反應(yīng)所需原料有T4噬菌體編碼的重組酶蛋白uvsX和uvsY、單鏈結(jié)合蛋白gp32、DNA聚合酶以及寡聚核苷酸；同時還需要引物、探針、模板、ddH₂O和Mg²⁺等。該技術(shù)基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴增原理，模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制，在常溫下即可對目標(biāo)片段進行等溫擴增，擺脫了對熱循環(huán)儀器的要求，可在短時間內(nèi)快速擴增出目的片段，具有簡便，快速，靈敏等優(yōu)點。

目前RPA技術(shù)已經(jīng)在多種病原生物的分子檢測中得到應(yīng)用，如結(jié)核分枝桿菌、口蹄疫病毒、犬細小病毒、非洲豬瘟、牛環(huán)型泰勒蟲、隱孢子蟲、弓形蟲、血吸蟲等。但是未見RPA技術(shù)在棘球絳蟲檢測中的應(yīng)用。因此，建立一種簡便、快速、有效的棘球絳蟲RPA檢測方法，對于棘球蚴病的防控具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容