[發明專利]一種合成環匹阿尼酸衍生物的突變菌株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201810516491.3
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN110527636A
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: 王楠;曹婷;路旭
• 申請（專利權）人: 中國科學院沈陽應用生態研究所
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/90;C12P21/02;C12R1/66;C12R1/80
• 代理公司: 21002 沈陽科苑專利商標代理有限公司
• 代理人: 李穎<國際申請>=<國際公布>=<進入國

本發明涉及一種環匹阿尼酸(CPA)的突變生物合成菌株的構建及應用。涉及含CPA生物合成基因簇的微生物中負責合成環乙酰乙酰基?L?色氨酸(cAATrp)的cpaS基因敲除及基因型和表型的驗證。主要采用的手段為采用融合PCR構建同源重組載體，并通過PEG/CaCl₂介導的原生質體轉化法進行同源重組失活cpaS基因。通過抗性基因篩選獲得相應的突變菌株，即為CPA的突變生物合成體系。可用該突變菌株通過飼喂該菌株cAATrp的類似物來合成CPA衍生物。

技術領域

本發明涉及菌株的構建，具體的說是一種合成環匹阿尼酸衍生物(CPA)的突變菌株及其構建方法和應用。

背景技術

CPA是一類含有吲哚結構母核的含氮雜環類微生物次生代謝物當用CPA處理植物根部時，CPA會干擾正常植物細胞溶質中引起植物向地性的鈣離子信號，使植物根部向地性受到很大抑制。此外CPA還有其它顯著活性，如抗煙草花葉病毒活性和殺蟲活性等。CPAs雖被稱為真菌毒素，但其毒性較弱，目前尚未見有對人畜致毒性的報道。CPA微弱的毒性使其相對于其它真菌毒素例如黃曲霉毒素、單端孢霉烯族毒素等受到較少關注。

CPA的生物合成途徑及基因簇相對簡單：CPA類化合物是在CPA合成酶(CpaS)、環乙酰乙酰基-L-色氨酸二甲烯丙基轉移酶(CpaD)以及氧化環化酶(CpaO)三個酶依次作用下，由一分子的色氨酸(Trp)、乙酰輔酶A、丙二酰基輔酶A及焦磷酸二甲基烯丙酯合成的。其中CpaS是一個PKS-NRPS雜合酶，負責將乙酰輔酶A、丙二酰基輔酶A及Trp組裝成CPA的第一個前體化合物cAATrp。cAATrp進一步在CpaD的催化下選擇性地在C-4位發生異戊烯基化修飾，生成第二個中間產物β-CPA。CpaO最后催化β-CPA發生氧化環合生成終產物α-CPA。進而可為摸索發現新型CPA類化合物提供更多可能。

發明內容

本發明的目的是提供一種合成環匹阿尼酸突變生物合成菌株及其構建方法及其應用。

為實現上述目的，本發明采用技術方案為：

一種合成環匹阿尼酸衍生物的突變菌株，采用融合PCR及原生質體轉化法敲除真菌的CPA生物合成基因簇中的負責合成cAATrp的環乙酰乙酰基-L-色氨酸(cAATrp)的cpaS基因，即獲得合成環匹阿尼酸衍生物的突變菌株。

所述真菌為含有CPA生物合成基因簇，在基因敲除前能夠產生CPA類化合物的真菌。

真菌為青霉菌(Penicillium)或曲霉菌(Aspergillus)。

一種合成環匹阿尼酸衍生物的突變菌株的構建方法，采用融合PCR及原生質體轉化法敲除真菌的CPA生物合成基因簇中的負責合成cAATrp的環乙酰乙酰基-L-色氨酸(cAATrp)的cpaS基因，即獲得合成環匹阿尼酸衍生物的突變菌株。

所述將培養10-24h的菌株的菌絲體加入至含有抗生素吡啶硫胺素(PT)、滲透壓穩定劑和混合酶溶液的高滲察氏選擇培養基，使菌絲體于25-35℃酶解2-5h獲得原生質體，將獲得的原生質體經高滲察氏選擇培養基稀釋，稀釋后與融合基因片段混合離心收集轉化的原生質體，轉化的原生質體再與高滲察氏軟瓊脂選擇培養基混合，平鋪到高滲察氏選擇平板上篩選轉化子，即為合成環匹阿尼酸衍生物的突變菌株。

所述融合基因片段是指含有與cpaS基因同源的上下臂以及吡啶硫胺素抗性基因的基因片段；所述抗生素吡啶硫胺素為能夠干擾硫胺素代謝的硫胺素(維生素B1)抑制劑。

所述混合酶為蝸牛酶(Snailase)、纖維素酶(Cellulase)和溶菌酶(Lysozyme)，加入后高滲察氏選擇培養基中終濃度至依次為0.5-3(wt)％、0.5-3(wt)％、0.1-2(wt)％。優選蝸牛酶、纖維素酶及溶菌酶的最佳配比分別為1％，1％，0.5％。

所述酶解溫度為30℃，菌絲酶解時間優選2.5h。