[發(fā)明專(zhuān)利]一種合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810516491.3
• 申請(qǐng)日: 2018-05-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN110527636A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王楠;曹婷;路旭
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/15
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/15;C12N15/90;C12P21/02;C12R1/66;C12R1/80
• 代理公司: 21002 沈陽(yáng)科苑專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 李穎<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入國(guó)

1.一種合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株，其特征在于：采用融合PCR及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法敲除真菌的CPA生物合成基因簇中的負(fù)責(zé)合成cAATrp的環(huán)乙酰乙酰基-L-色氨酸(cAATrp)的cpaS基因，即獲得合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株。

2.按權(quán)利要求1所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株，其特征在于：所述真菌為含有CPA生物合成基因簇，在基因敲除前能夠產(chǎn)生CPA類(lèi)化合物的真菌。

3.按權(quán)利要求2所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株，其特征在于：真菌為青霉菌(Penicillium)或曲霉菌(Aspergillus)。

4.一種權(quán)利要求1所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：采用融合PCR及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法敲除真菌的CPA生物合成基因簇中的負(fù)責(zé)合成cAATrp的環(huán)乙酰乙酰基-L-色氨酸(cAATrp)的cpaS基因，即獲得合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株。

5.按權(quán)利要求4所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述將培養(yǎng)10-24h的菌株的菌絲體加入至含有抗生素吡啶硫胺素(PT)、滲透壓穩(wěn)定劑和混合酶溶液的高滲察氏選擇培養(yǎng)基，使菌絲體于25-35℃酶解2-5h獲得原生質(zhì)體，將獲得的原生質(zhì)體經(jīng)高滲察氏選擇培養(yǎng)基稀釋?zhuān)♂尯笈c融合基因片段混合離心收集轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再與高滲察氏軟瓊脂選擇培養(yǎng)基混合，平鋪到高滲察氏選擇平板上篩選轉(zhuǎn)化子，即為合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株。

6.按權(quán)利要求5所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述融合基因片段是指含有與cpaS基因同源的上下臂以及吡啶硫胺素抗性基因的基因片段；所述抗生素吡啶硫胺素為能夠干擾硫胺素代謝的硫胺素(維生素B1)抑制劑。

7.按權(quán)利要求5所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述混合酶為蝸牛酶(Snailase)、纖維素酶(Cellulase)和溶菌酶(Lysozyme)，加入后高滲察氏選擇培養(yǎng)基中終濃度至依次為0.5-3(wt)％、0.5-3(wt)％、0.1-2(wt)％。

8.按權(quán)利要求5所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述酶解溫度為30℃，菌絲酶解時(shí)間優(yōu)選2.5h。

9.按權(quán)利要求5所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株的構(gòu)建方法，其特征在于：所述滲透壓穩(wěn)定劑為NaCl、MgSO₄、蔗糖、山梨醇中的任何一種。

10.一種權(quán)利要求1所述的合成環(huán)匹阿尼酸衍生物的突變菌株的應(yīng)用，其特征在于：所述突變菌株在合成環(huán)匹阿尼酸衍生物中的應(yīng)用。