[發(fā)明專利]快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒及方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810514985.8
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN108411016A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 干馳;胡金鳳;莫茜;曹清;王志剛;李玉蟬;蔡海清;徐蘊嵐;陶悅;趙瑞珂;杜白露;沈楠
• 申請（專利權(quán)）人: 上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/14;C12Q1/04
• 代理公司: 上海韌辰專利代理有限公司 31331
• 代理人: 劉秋蘭

1.一種快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括：

引物組，所述引物組包括：金黃色葡萄球菌或耐甲氧西林金黃色葡萄球菌nuc基因引物、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因引物、化膿鏈球菌spyM基因引物和銅綠假單胞菌oprI基因引物。

2.如權(quán)利要求1所述的快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述nuc基因引物包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:2所示的下游引物序列；

所述mecA基因引物包括如SEQ ID NO:3所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:4所示的下游引物序列；

所述spyM基因引物包括如SEQ ID NO:5所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:6所示的下游引物序列；

所述oprI基因引物包括如SEQ ID NO:7所示的上游引物序列和如SEQ ID NO:8所示的下游引物序列。

3.如權(quán)利要求1或2所述的快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述nuc基因引物、mecA基因引物、spyM基因引物和oprI基因引物的上游引物和下游引物的原始濃度分別為9～11μmol/L優(yōu)選10μmol/L。

4.如權(quán)利要求3所述的快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒，其特征在于，在所述引物組中，所述nuc基因引物的上游引物和下游引物的體積各為0.3μL，所述spyM基因引物的上游引物和下游引物的體積各為0.15μL，所述mecA基因引物的上游引物和下游引物的體積各為0.4μL，所述oprI基因引物的上游引物和下游引物的體積各為0.3μL。

5.如權(quán)利要求1或2所述的快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR檢測試劑盒還包括多重PCR緩沖液和多重PCR DNA聚合酶混合液，所述多重PCR緩沖液的體積為12.5μL，所述多重PCR DNA聚合酶混合液的體積為0.125μL。

6.如權(quán)利要求1或2所述的快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR檢測試劑盒包括無菌水的陰性對照。

7.如權(quán)利要求1或2所述的快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR檢測試劑盒還包括DNA標記。

8.如權(quán)利要求7所述的快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA標記是以金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌、銅綠假單胞菌標準菌株基因組為模板分別采用PCR擴增純化后的等體積比混合物。

9.一種使用權(quán)利要求1或2所述的PCR檢測試劑盒快速檢測骨關(guān)節(jié)感染常見細菌的方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟S1基于待檢測樣品上的細菌制備得到PCR模板；

步驟S2在引物組的特異性的結(jié)合下根據(jù)PCR模板在PCR反應(yīng)液中進行PCR擴增；

步驟S3對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，與DNA標記對比判斷是否感染了金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、化膿鏈球菌和/或銅綠假單胞菌。

10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于：在步驟S2中，具體PCR反應(yīng)液包括：12.5μL多重PCR緩沖液，0.125μL多重PCR DNA聚合酶混合液，10μmol/L nuc基因引物的上游引物如SEQ ID NO:1所示和下游引物如SEQ ID NO:2所示體積各0.3μL，10μmol/L spyM基因引物的上游引物如SEQ ID NO:5所示和下游引物如SEQ ID NO:6所示體積各0.15μL，10μmol/LmecA基因引物的上游引物如SEQ ID NO:3所示和下游引物如SEQ ID NO:4所示體積各0.4μL，10μmol/L oprI基因引物的上游引物如SEQ ID NO:7所示和下游引物如SEQ ID NO:8所示體積各0.3μL，8.075μL無菌水和2μL模板；PCR反應(yīng)條件為94～95℃預(yù)變性3～5min；94～95℃下變性15～20s，60～61℃下退火15～20s，72℃下延伸20s，擴增35個循環(huán)；72℃延伸5min。