[發明專利]一種念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法

在審

• 申請號: 201810512773.6
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN108795689A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發明（設計）人: 邵菁;汪天明;施高翔;段強軍;陸克喬;李倩倩;吳大強;汪長中
• 申請（專利權）人: 安徽中醫藥大學
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

1.一種念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法，其特征在于：包括一念珠菌屬真菌生物被膜流動模型裝置，該念珠菌屬真菌生物被膜流動模型裝置包括一個用于容納真菌培養基的第一容器、一蠕動泵、一個分液進樣器、四個用于生物被膜孵育的第二容器和一個容納流出液的第三容器；所述分液進樣器設有一個進液孔，在所述進液孔的下方設有四個出液孔；所述第二容器的頂部設有頂部孔，底部設有底部孔；所述四個用于生物被膜孵育的第二容器位于同一水平面上，所述分液進樣器的進液孔通過管路與所述蠕動泵的出液口連通，所述蠕動泵的進液口通過管路與所述第一容器連通，所述分液進樣器的出液孔分別通過管路與所述第二容器的底部孔連通，所述第二容器的頂部孔分別通過管路與所述第三容器連通；

所述制備方法包括下列步驟：

第一步：首先將念珠菌屬真菌菌株接種于SDB培養基中進行孵育，然后離心收集菌細胞，接著用無菌PBS緩沖液清洗，收集的菌細胞重懸于RPMI-1640培養基中，再孵育12~18小時后得到真菌培養液；

第二步：對所述真菌培養液進行離心分離，收集下沉的真菌細胞，添加真菌培養基至真菌細胞濃度為4-6×10⁶CFU/ml，得到重懸菌液；

第三步：將四個醫用導管片放置到所述重懸菌液中，搖床孵育使菌體黏附到所述醫用導管片上，然后取出所述醫用導管片，用pH值為7.2的無菌磷酸緩沖液清洗除去黏附不牢的真菌細胞，接著將所述醫用導管片分別放置到所述第二容器內，所述第二容器內容納有真菌培養基，靜置培養1.5~2.5小時后打開所述蠕動泵，流動孵育19~20小時；

第四步：將第三步得到的醫用導管片先用pH值為7.2的無菌磷酸緩沖液清洗，然后放入容納有pH值為7.2的無菌磷酸緩沖液的試管中，接著采用超聲波處理至所述醫用導管片上不含真菌細胞，收集得到含菌溶液；

第五步：將所述含菌溶液用pH值為7.2的無菌磷酸緩沖液稀釋得到稀釋液，然后將稀釋液與XTT-維生素K3溶液混合于微孔板中，孵育后的菌液在492nm波長下檢測其OD值。

2.根據權利要求1所述的念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法，其特征在于：每升所述真菌培養基含有400mg的氯化鉀、6000mg的氯化鈉、2000mg的葡萄糖、290.00mg的L-精氨酸、50mg的 L-天冬酰胺、20mg的L-天冬氨酸、65.15mg的L-胱氨酸二鹽酸鹽、20mg的L-谷氨酸、10mg的甘氨酸、15mg的L-組氨酸、20mg的L-羥脯氨酸、50mg的L-異亮氨酸、50mg的L-亮氨酸、40mg的L-賴氨酸、15mg的L-甲硫氨酸、15mg的L-苯丙氨酸、20mg的L-脯氨酸、30mg的L-絲氨酸、20mg的L-蘇氨酸、5mg的L-色氨酸、23.19mg的L-酪氨酸、20mg的L-纈氨酸，100ml的質量濃度為10%的胎牛血清，其余為純化水，然后用3-(N-瑪琳代)丙磺酸調整pH值至7.0。

3.根據權利要求1所述的念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法，其特征在于：每升SDB培養基含有10g蛋白胨，20g瓊脂粉，40g葡萄糖和0.1g氯霉素。

4.根據權利要求1所述的念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法，其特征在于：所述RPMI-1640培養基的原料配方包含下列質量百分比的原料：1%的甘露醇、1%的營養肉湯、0.2%的K₂HPO₄和1.35%的瓊脂粉。