[發(fā)明專利]一種念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810512773.6
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN108795689A
• 公開（公告）日: 2018-11-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵菁;汪天明;施高翔;段強軍;陸克喬;李倩倩;吳大強;汪長中
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

一種真菌生物被膜流動模型的制備方法，包括真菌生物被膜流動模型裝置構(gòu)建、真菌菌種培養(yǎng)、真菌生物被膜孵育、真菌生物被膜評價、掃描電子顯微鏡檢測。本發(fā)明的念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法，具有操作簡易，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好的優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法。

背景技術(shù)

真菌生物被膜是指真菌附著于宿主腔道或生物材料表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂蛋白等，將自身包繞其中而形成的膜樣多細(xì)胞復(fù)合體。許多研究發(fā)現(xiàn)，各種真菌耐藥程度與生物被膜形成過程有關(guān)，生物被膜越成熟，真菌的耐藥性越強。

真菌在細(xì)胞體內(nèi)、體外都可能形成生物被膜。體外生物被膜的形成方式主要有“靜態(tài)、動態(tài)”兩種，其中動態(tài)下形成的生物被膜由于形成的胞外基質(zhì)更為豐富，結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，從而使得被膜真菌有著更強的耐藥性。

體外生物被膜模型包括靜止和流動兩種。生物被膜流動模型指真菌等微生物在流動狀態(tài)下形成的生物被膜。目前常用的生物被膜流動模型大多操作比較復(fù)雜，通量相對較小，且很少用于混合生物被膜的孵育。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種念珠菌屬真菌生物被膜流動模型的制備方法，包括一念珠菌屬真菌生物被膜流動模型裝置，該念珠菌屬真菌生物被膜流動模型裝置包括一個用于容納真菌培養(yǎng)基的第一容器、一蠕動泵、一個分液進樣器、四個用于生物被膜孵育的第二容器和一個容納流出液的第三容器；所述分液進樣器設(shè)有一個進液孔，在所述進液孔的下方設(shè)有四個出液孔；所述第二容器的頂部設(shè)有頂部孔，底部設(shè)有底部孔；所述四個用于生物被膜孵育的第二容器位于同一水平面上，所述分液進樣器的進液孔通過管路與所述蠕動泵的出液口連通，所述蠕動泵的進液口通過管路與所述第一容器連通，所述分液進樣器的出液孔分別通過管路與所述第二容器的底部孔連通，所述第二容器的頂部孔分別通過管路與所述第三容器連通；

所述制備方法包括下列步驟：

第一步：首先將念珠菌屬真菌菌株接種于SDB培養(yǎng)基中進行孵育，然后離心收集菌細(xì)胞，接著用無菌PBS緩沖液清洗，收集的菌細(xì)胞重懸于RPMI-1640培養(yǎng)基中，再孵育12~18小時后得到真菌培養(yǎng)液；

第二步：對所述真菌培養(yǎng)液進行離心分離，收集下沉的真菌細(xì)胞，添加真菌培養(yǎng)基至真菌細(xì)胞濃度為4-6×10⁶CFU/ml，得到重懸菌液；

第三步：將四個醫(yī)用導(dǎo)管片放置到所述重懸菌液中，搖床孵育使菌體黏附到所述醫(yī)用導(dǎo)管片上，然后取出所述醫(yī)用導(dǎo)管片，用pH值為7.2的無菌磷酸緩沖液清洗除去黏附不牢的真菌細(xì)胞，接著將所述醫(yī)用導(dǎo)管片分別放置到所述第二容器內(nèi)，所述第二容器內(nèi)容納有真菌培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)1.5~2.5小時后打開所述蠕動泵，流動孵育19~20小時；

第四步：將第三步得到的醫(yī)用導(dǎo)管片先用pH值為7.2的無菌磷酸緩沖液清洗，然后放入容納有pH值為7.2的無菌磷酸緩沖液的試管中，接著采用超聲波處理至所述醫(yī)用導(dǎo)管片上不含真菌細(xì)胞，收集得到含菌溶液；

第五步：將所述含菌溶液用pH值為7.2的無菌磷酸緩沖液稀釋得到稀釋液，然后將稀釋液與XTT-維生素K3溶液混合于微孔板中，孵育后的菌液在492nm波長下檢測其OD值。