[發明專利]一種香樟SSR引物組合及其品種鑒定方法

有效

• 申請號: 201810504433.9
• 申請日: 2018-05-23
• 公開（公告）號: CN108384885B
• 公開（公告）日: 2019-12-17
• 發明（設計）人: 鐘永達;胥猛;酈芝汀;余發新;徐立安
• 申請（專利權）人: 江西省科學院生物資源研究所;南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 32274 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 邱興天

本發明公開了一種香樟SSR引物組合物及其品種鑒定方法，用于香樟品種的快速分子檢測與鑒定，屬于植物新品種分子鑒定領域。本發明設計了4對SSR引物，并利用它們成功構建了11個香樟品種指紋圖譜，可快速、準確地區分各香樟品種。本發明基于4對SSR引物，進行一次PCR擴增反應，利用8％聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，利用引物組合法，可直接根據產物的片段進行判斷。本發明可直接應用于香樟不同品種的分子鑒定，具有很好的實用性。

技術領域

本發明屬于植物新品種鑒定技術領域，涉及一種香樟SSR引物組合物及其品種檢測方法，專用于不同香樟品種的分子檢測和鑒定。

背景技術

香樟(Cinnamomum camphora)是樟科樟屬的常綠闊葉大喬木，是國家II級重點保護植物。香樟生長迅速，樹冠開展，樹形美觀，可作綠化行道樹，或栽植為園景樹。樟籽含有豐富的油脂，可以直接應用于化妝品中；葉片含有的樟油，可用來提煉樟腦或制成化學原料；木材具有耐腐蝕、密度高、帶有濃郁香氣的特質，是制作家具和木材雕刻藝術品上佳材料，深受人們的青睞。同時，除具有材性優良、冠型優美等特點外，葉片中富含的次生代謝物具有一定藥用價值，故香樟是我國珍貴用材樹種和經濟樹種。香樟“贛彤”為江西省科學院生物資源研究所選育的紅桿香樟，主要表現為莖桿全年為紅色，且葉色隨著季節產生變化；“霞光”為浙江寧波市林業局林特種苗繁育中心的紅葉樟樹，春天時葉片外紅里白，夏天時變成外白里紅。

簡單序列重復(simple sequence repeats，SSRs)，又稱為微衛星DNA，是一類由1～6個核苷酸串聯重復數次組成的核苷酸序列。其長度一般在100bp以下，廣泛分布于植物基因組內，而重復次數的不同及重復程度的不完全則賦予SSR位點豐富的多態性。同時，SSR標記具有共顯性、重復性好、多態性豐富等優點，是構建遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳結構、不同品種分子鑒定的理想工具。然而，SSR標記在香樟品種分類和鑒定方面的應用尚未見報道，故現需建立一種快速、準確鑒定香樟品種的分子手段，以更好的保護和利用香樟品種資源。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種香樟SSR分子檢測引物組合物，克服以往香樟品種鑒定方法存在的缺陷，提供準確可靠、易于操作、靈敏度高的分子檢測方法。本發明的另一目的是提供一種使用香樟品種分子檢測引物組合物快速檢測香樟品種方法，該方法可以直接應用于生產實踐，對于香樟苗木的鑒定具有十分重要的意義。

技術方案：為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

一種香樟品種分子鑒定引物組合物，由4對引物組成，其引物序列如下表所示：

應用所述的香樟品種分子檢測引物組合物構建香樟品種指紋代碼，所獲得的11個香樟品種對應指紋代碼如下表所示：

一種應用所述的引物組合物快速鑒定香樟品種的方法，包括以下步驟：

1)提取待測樣品DNA

2)使用相同的反應體系和反應程序，按權利要求1表格中的引物順序依次對待測香樟樣本進行PCR擴增；

3)PCR產物則利用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染法進行檢測，依據擴增產物的有無和大小進行判讀，對照品種指紋代碼，鑒定待測樣品的品種。

步驟1)中，利用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒完成待測樣品DNA提取。

步驟2)中，10μL PCR擴增反應體系包括：1μ10×Buffer；0.75mM MgCl₂；0.025mMdNTPs；1U Taq DNA聚合酶；0.4μM SSR引物和30ng DNA模板。