[發明專利]一種檢測鑒定昆蟲體內Wolbachia感染的特異性引物、方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201810504166.5
• 申請日: 2018-05-23
• 公開（公告）號: CN108707681B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 何曉芳;林良冠;張美嬌
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

本發明公開了一種檢測鑒定昆蟲體內Wolbachia感染的特異性引物、方法和試劑盒。所述特異性擴增引物Tw16s1，包括正向引物F和反向引物R，其序列依次如SEQ ID NO：1～2所示。所述檢測方法為：S1.提取待測昆蟲總DNA；S2.以S1的DNA為模板，利用所述引物進行PCR擴增反應；S3.將S2的PCR擴增反應產物電泳檢測，從而進行判斷。本發明所述引物特異性強，擴增產物為單一目的片段，而且靈敏度高，能篩選出假陰性、非特異性的樣品，從而提高檢出率。從提DNA到獲得結果僅需要4個小時左右。可以精確、快速地發現檢測出樣品中是否受Wolbachia感染，為進一步得用進行疾病預防和對昆蟲進行生殖調控提供基礎。

技術領域

本發明涉及昆蟲體內共生菌的分子檢測技術領域，更具體地，涉及一種檢測鑒定昆蟲體內Wolbachia感染的引物組、方法和試劑盒。

背景技術

Wolbachia是廣泛分布于節肢動物生殖組織內的一類共生細菌，約75％的物種感染Wolbachia。Wolbachia與宿主有共生關系，例如引起淋巴絲蟲病的絲蟲與其體內的Wolbachia是互惠共生關系，Wolbachia控制著絲蟲的生長、發育和在蚊子體內的生存。檢測出Wolbachia就是防止媒介昆蟲傳播淋巴絲蟲病的首要條件。

另外，Wolbachia還對宿主具有生殖調控的作用。Wolbachia對寄主的作用主要體現在其對生殖的調控方面，在進化過程中與寄主逐漸形成了協同進化的關系(Werren etal.,2008)，形成了多種調節宿主生殖方式的機制。這些機制主要包括：1、引起寄主的細胞質不親和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)，影響著蠅類、蚊類等類群的種內雜交產生很少后代或者沒有后代。2、誘導孤雌生殖(Parthenogenetic Induction，PI)；誘導孤雌生殖現象(PI)多發生于單-雙倍體性別決定系統的昆蟲中。單-雙倍體性別決定系統是指在正常情況下，未受精的卵(單倍體)發育成雄性，而受精卵(雙倍體)發育成雌性。3、引起雄性的雌性化(Feminization)；4、殺雄作用(Male Killing)是指寄主在發育過程中，雄性胚胎或者幼蟲不能成活。檢測出Wolbachia就可以利用相關調控機理對害蟲進行治理，對益蟲進行利用。

目前已報道的檢測Wolbachia的方法主要是依靠特異PCR或特異探針雜交技術。其中，16s、wsp、fts這三個基因及其引物是最常用于Wolbachia檢測的幾種靶標基因。這些引物存在著以下的欠缺：1、假陰性結果，例如wsp引物(81F和691R))。但是Wolbachia在不同的宿主有不同的變異，因此在利用現在的16S引物擴增某些昆蟲體內Wolbachia的過程中遇到一些假陰性的結果，導致最后錯誤的結論。2、非特異性擴增，結合位點過多，PCR結果經常出現非專一的條帶，無從判斷是否為陽性結果。例如：16s(Wol-16s-F，Wol-16s-R)，wsp引物(81F和691R)和fts引物(ftsZ，ftsA和ftsB)。3、非Wolbachia目標檢測，現在常用的16S引物為通用引物，如果PCR擴增出陽性結果后，還需要進一步測序才能確定是否為Wolbachia或是其他的微生物，針對Wolbachia感染鑒定的特異性還欠缺，例如：16s(27F，1494R，1513R)。

因此，開發一種特異引物就顯得尤為重要。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是克服現有Wolbachia檢測引物和方法存在假陰性、非特異性的缺陷和不足，利用NCBI網上的現有的Wolbachia16S基因序列重新設計并通過大量篩選后，獲得更靈敏、更精確的16S特異引物，以便能夠進行Wolbachia的鑒定。

本發明的第一個目的是提供一種檢測鑒定昆蟲體內Wolbachia感染的特異性擴增引物Tw16s1。

本發明的第二個目的是提供一種檢測鑒定昆蟲體內Wolbachia感染的方法。