[發(fā)明專利]豬細(xì)小病毒VLPs抗體檢測試劑盒及其制備方法、應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810501998.1
• 申請日: 2018-05-23
• 公開（公告）號(hào): CN108776225A
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭慧琛;孫世琪;白滿元;韓世充;董虎;宋品;魏衍全;張韻;殷宏
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明公開了豬細(xì)小病毒VLPs抗體檢測試劑盒及其制備方法、應(yīng)用，其檢測試劑盒包括預(yù)包被豬細(xì)小病毒VLPs的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液。本發(fā)明是首次采用豬細(xì)小病毒的病毒樣顆粒作為包被抗原，建立了可檢測豬細(xì)小病毒的試劑盒，還試劑盒可對血清中的豬細(xì)小病毒的抗體水平進(jìn)行快速檢測；本發(fā)明試劑盒檢測敏感性高、特異性和可重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定。同時(shí)所采用的病毒樣顆粒對操作者和環(huán)境安全無害、無傳染性。另外本發(fā)明試劑盒應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)，因而具有經(jīng)濟(jì)、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種豬細(xì)小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒及其制備方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)是一種耐受性極強(qiáng)且具有高度傳染性的病毒，是導(dǎo)致母豬繁殖障礙的病原之一，豬細(xì)小病毒病的臨床主要特征是妊娠母豬流產(chǎn)、胎兒死亡和木乃伊化。該病與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征以及豬滲出性皮炎等疾病有關(guān)，易感成年豬如果在交配期間或者妊娠期間暴露在PPV存在的環(huán)境中，該病毒會(huì)很容易穿過胎盤屏障感染胚胎和胎兒。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病呈全球性分布，特別對妊娠母豬和仔豬危害較大，阻礙了豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程，經(jīng)濟(jì)損失巨大。所以對于PPV的預(yù)防、診斷就顯得尤為重要。

病毒樣顆粒(VLPs)是由病毒的衣殼蛋白形成的空心顆粒，具有和天然病毒粒子相同或相似的形態(tài)，但不含病毒遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制，因此不會(huì)產(chǎn)生任何可能導(dǎo)致感染的遺傳成分。并且衣殼蛋白組裝成VLPs時(shí)，通過各亞單位之間的相互作用可以形成單個(gè)蛋白不具有的立體構(gòu)象，而且可以重復(fù)并高密度的展示抗原位點(diǎn)。因此相對于單個(gè)病毒蛋白，使用VLPs對血清抗體檢測具有更強(qiáng)的免疫原性和更高特異性。VLPs的天然生物學(xué)結(jié)構(gòu)類似于親本病毒顆粒，可以近乎完美的展示誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，因此免疫性強(qiáng)，不但能激發(fā)體液免疫反應(yīng)，還可以激發(fā)細(xì)胞和粘膜免疫。VLPs具備安全、高效的特點(diǎn)，是未來具有廣闊發(fā)展前景的候選疫苗或傳遞抗原的載體。

目前PPV的診斷方法主要有免疫過氧化酶單層細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(IPMA)、間接免疫熒光(IFA)、間接ELISA以及競爭ELISA等，但由于IPMA和IFA要求比較高，不適合大規(guī)模的PPV抗體檢測。目前用于檢測PPV抗體的ELISA方法大多是以滅活病毒、重組病毒、單個(gè)蛋白或多肽等作為抗原，但是以完整病毒粒子作為抗原存在安全風(fēng)險(xiǎn)，單個(gè)蛋白或多肽的免疫原性相對較差。

因此，現(xiàn)有技術(shù)有待于進(jìn)一步發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明申請的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好的用于豬細(xì)小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒及其制備方法、應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種豬細(xì)小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其中，包括預(yù)包被豬細(xì)小病毒VLPs的酶標(biāo)板、封閉液、樣品稀釋液、酶結(jié)合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液。

所述的豬細(xì)小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其中，所述豬細(xì)小病毒VLPs通過以下步驟制得：

1)對豬細(xì)小病毒毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成，并基于優(yōu)化后基因序列制備pUC-VP2重組質(zhì)粒；

2)利用pUC-VP2重組質(zhì)粒和pSMK載體質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒pSMK-VP2；

3)將重組質(zhì)粒pSMK-VP2轉(zhuǎn)化大腸桿菌并誘導(dǎo)表達(dá)得到VLPs。

所述的豬細(xì)小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其中，豬細(xì)小病毒毒株結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化合成，合成后核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的豬細(xì)小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其中，利用pUC-VP2重組質(zhì)粒和pSMK載體質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒pSMK-VP2具體為：