[發明專利]豬細小病毒VLPs抗體檢測試劑盒及其制備方法、應用

在審

• 申請號: 201810501998.1
• 申請日: 2018-05-23
• 公開（公告）號: CN108776225A
• 公開（公告）日: 2018-11-09
• 發明（設計）人: 郭慧琛;孫世琪;白滿元;韓世充;董虎;宋品;魏衍全;張韻;殷宏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種豬細小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，包括預包被豬細小病毒VLPs的酶標板、封閉液、樣品稀釋液、酶結合物、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液。

2.根據權利要求1所述的豬細小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述豬細小病毒VLPs通過以下步驟制得：

1)對豬細小病毒毒株結構蛋白VP2基因序列進行密碼子優化合成，并基于優化后基因序列制備pUC-VP2重組質粒；

2)利用pUC-VP2重組質粒和pSMK載體質粒構建重組質粒pSMK-VP2；

3)將重組質粒pSMK-VP2轉化大腸桿菌并誘導表達得到VLPs。

3.根據權利要求2所述的豬細小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，豬細小病毒毒株結構蛋白VP2基因序列進行密碼子優化合成，合成后核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根據權利要求2所述的豬細小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，利用pUC-VP2重組質粒和pSMK載體質粒構建重組質粒pSMK-VP2具體為：

1)將pUC-VP2重組質粒按照如下酶切體系進行酶切：pUC-VP2質粒35μL，Bsa I和BamH I各2.5μL，Cutsmart buffer 5μL，ddH2O 5μL；

將pSMK載體質粒按照以下體系進行酶切：pSMK載體質粒35μL，Bsa I 2.5μL，Cutsmartbuffer 5μL，ddH2O 7.5μL；

上述兩酶切體系通過瓊脂糖凝膠電泳確認pUC-VP2重組質粒和pSMK載體質粒切開后，回收基因VP2目的片段和pSMK表達載體；

2)將基因VP2目的片段和pSMK表達載體兩種膠回收產物按照以下反應體系進行連接，反應體系為：VP2目的片段4μL、pSMK表達載體1μL、5μL Solution I，混勻后16℃連接反應4h或者4℃過夜連接；

3)將連接產物轉化Trans5a克隆菌；

4)將Trans5a克隆菌接種于含有卡那霉素的LB液體培養基中，37℃、220rpm振蕩培養16h，將過夜培養后的菌液通過全菌PCR法和酶切凝膠電泳分析，鑒定出重組質粒pSMK-VP2。

5.根據權利要求4所述的豬細小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述將連接產物轉化Trans5a克隆菌具體為：

1)將5μL連接產物加入100μL Trans5a感受態細胞中，柔和混勻后冰浴30min；

2)42℃熱激90s后，立即冰浴3min；

3)加入42℃預熱后的LB液體培養基800μL，于37℃震蕩培養1h；

4)離心機4500rpm離心3min；

5)棄除部分上清，留100～300μL涂布在于含有50mg/L卡那霉素的LB瓊脂平板上；

6)37℃恒溫培養箱中倒置培養16～18h。

6.根據權利要求4所述的豬細小病毒VLPs ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述將過夜培養后的菌液通過全菌PCR法和酶切凝膠電泳分析，鑒定出重組質粒pSMK-VP2具體為：將過夜培養后的菌液接種于10μL PCR緩沖液體系中，利用全菌PCR法進行鑒定，將PCR反應鑒定為陽性的菌落，利用小量質粒提取試劑盒提取對應擴增菌的質粒，并進行雙酶切鑒定，其雙酶切體系如下：pSMK-VP2重組質粒6μL，Xba I 1.5μL，Xho I 1.5μL，Cutsmart 1μL，37℃酶切3h，重組質粒pSMK-VP2雙酶切反應結束后取酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，將鑒定陽性的質粒進行測序，測序結果正確的陽性質粒命名為重組質粒pSMK-VP2。