[發(fā)明專利]一種利用超分辨成像檢測(cè)端粒酶活性的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810490109.6
• 申請(qǐng)日: 2018-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN108642139A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宗慎飛;宗君珠;王著元;崔一平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6834
• 分類號(hào): C12Q1/6834;C12Q1/48;C12N15/11
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 葉涓涓

本發(fā)明公開了一種端粒酶活性檢測(cè)方法，包括：利用CHAPS法提取待測(cè)細(xì)胞中的端粒酶；利用捕獲探針和端粒酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與信號(hào)探針溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)；用超分辨成像技術(shù)對(duì)雜交反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明采用超分辨成像技術(shù)能夠檢測(cè)到低濃度端粒酶形成的微弱信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了更高靈敏度的端粒酶活性檢測(cè)；采用Cy5染料修飾的端粒互補(bǔ)序列DNA作為信號(hào)探針，獲得更高分辨率的圖像及更低的檢測(cè)限；避免了PCR反應(yīng)過程以及信號(hào)擴(kuò)增過程，大大簡化了端粒酶活性檢測(cè)步驟，同時(shí)也提高了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及端粒酶活性檢測(cè)領(lǐng)域，涉及檢測(cè)端粒酶活性方法，更為具體的說是涉及一種具體是通過超分辨成像技術(shù)檢測(cè)端粒酶活性的方法。

背景技術(shù)

端粒是存在于真核細(xì)胞線狀染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)。端粒和端粒結(jié)合蛋白一起在染色體末端形成“帽狀”結(jié)構(gòu)，維持染色體的完整和細(xì)胞活性。端粒會(huì)隨著細(xì)胞的不斷分裂而縮短，這會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。端粒酶是一種由RNA和蛋白組成的核糖核蛋白，能在染色體末端不斷合成端粒序列，從而在細(xì)胞分裂過程中維持端粒的長度。正常體細(xì)胞中的端粒酶的活性被抑制，然而85％以上的腫瘤細(xì)胞顯端粒酶活性，因此端粒酶與腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系。端粒酶不僅可以作為癌癥早期診斷依據(jù)和預(yù)后指標(biāo)，還能夠成為癌癥治療的有效靶點(diǎn)。因此，對(duì)于端粒酶結(jié)構(gòu)、功能、活性及作用機(jī)理的研究具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

端粒酶的檢測(cè)方法主要可分為直接引物延伸法和端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomeric repeatamplificationprotocol，TRAP)兩類。其中端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法通過PCR擴(kuò)增端粒酶合成的端粒序列，由于擴(kuò)增過程受許多因素影響，在提高檢測(cè)靈敏度的同時(shí)容易造成假陰性的結(jié)果。此外還有比色法、化學(xué)發(fā)光法、表面等離子激元共振法、熒光共振能量轉(zhuǎn)移法等避免了PCR過程的檢測(cè)端粒酶的方法，他們或多多少存在一些諸如檢測(cè)靈敏度不夠，過程復(fù)雜的缺點(diǎn)。因此，具有低檢測(cè)限，高靈敏度，檢測(cè)過程簡便的端粒酶檢測(cè)方法亟待提出。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明公開了一種端粒酶活性檢測(cè)方法，利用超分辨成像超越衍射極限的高空間分辨率能夠檢測(cè)低濃度的端粒酶活性，且無需復(fù)雜的信號(hào)擴(kuò)增步驟。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種利用超分辨成像檢測(cè)端粒酶活性的方法，包括如下步驟：

第一步，利用CHAPS法提取待測(cè)細(xì)胞中的端粒酶；

第二步，利用捕獲探針和端粒酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物與信號(hào)探針溶液進(jìn)行雜交反應(yīng)；所述的捕獲探針為摻雜染料的二氧化硅納米球表面修飾端粒酶底物；所述的信號(hào)探針為修飾了染料分子的端粒互補(bǔ)序列；

第三步，用超分辨成像技術(shù)對(duì)雜交反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)獲得的兩個(gè)通道的圖像上點(diǎn)的重合情況以及DNA探針的熒光信號(hào)所獲得的圖像上點(diǎn)的大小判斷端粒酶的活性。信號(hào)探針的熒光越強(qiáng)，說明端粒酶活性越高。

進(jìn)一步的，所述第二步中延伸反應(yīng)步驟為：取200-300μL捕獲探針，與5μL 10mMdNTPs、1-2μL RNA酶抑制劑、5μL第一步中得到的端粒酶提取物混合，于30℃下振蕩1-2小時(shí)進(jìn)行端粒延伸反應(yīng)；所述反應(yīng)產(chǎn)物與信號(hào)探針的雜交反應(yīng)步驟包括：延伸反應(yīng)產(chǎn)物以2500-3000轉(zhuǎn)，15分鐘離心提純1次；去除上清后，將沉淀分散至200-300μL的PBS溶液中，再加入0.3-0.9μL10μM的信號(hào)探針進(jìn)行雜交反應(yīng)；該混合液30℃振蕩2-3小時(shí)，以2500g，15min離心提純，去除上清液，將雜交產(chǎn)物的沉淀分散至500-800μLPBS中。

進(jìn)一步的，所述捕獲探針的制備方法包括如下步驟：