[發明專利]一種利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法

在審

• 申請號: 201810490109.6
• 申請日: 2018-05-21
• 公開（公告）號: CN108642139A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 宗慎飛;宗君珠;王著元;崔一平
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/6834
• 分類號: C12Q1/6834;C12Q1/48;C12N15/11
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 葉涓涓

1.一種利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

第一步，利用CHAPS法提取待測細胞中的端粒酶；

第二步，利用捕獲探針和端粒酶進行延伸反應，反應產物與信號探針溶液進行雜交反應；所述的捕獲探針為摻雜染料的二氧化硅納米球表面修飾端粒酶底物；所述的信號探針為修飾了染料分子的端粒互補序列；

第三步，用超分辨成像技術對雜交反應產物進行檢測，根據獲得的兩個通道的圖像上點的重合情況以及DNA探針的熒光信號所獲得的圖像上點的大小判斷端粒酶的活性。

2.根據權利要求1所述的利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法，其特征在于，所述第二步中延伸反應步驟為：取200-300μL捕獲探針，與5μL 10mM dNTPs、1-2μL RNA酶抑制劑、5μL第一步中得到的端粒酶提取物混合，于30℃下振蕩1-2小時進行端粒延伸反應；所述反應產物與信號探針的雜交反應步驟包括：延伸反應產物以2500-3000轉，15分鐘離心提純1次；去除上清后，將沉淀分散至200-300μL的PBS溶液中，再加入0.3-0.9μL10μM的信號探針進行雜交反應；該混合液30℃振蕩2-3小時，以2500g，15min離心提純，去除上清液，將雜交產物的沉淀分散至500-800μLPBS中。

3.根據權利要求1所述的利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法，其特征在于，所述捕獲探針的制備方法包括如下步驟：

配制10mM EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)溶液和10mM NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)溶液，取10-20μL 10μM TS Primer(端粒酶引物，序列為5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3')溶于PBS溶液中，再分別加入10-20μL EDC溶液和10-20μLNHS溶液，加入50-60μL摻雜FITC(異硫氰酸熒光素)的二氧化硅納米球溶液，置于搖床中振蕩反應12-16小時；將反應物以2500-4000轉，15分鐘離心1-2次提純；去除上清，沉淀分散于2mLPBS溶液中，即得到捕獲探針。

4.根據權利要求1所述的利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法，其特征在于，所述摻雜FITC的二氧化硅納米球的制備方法包括如下步驟：

在1mL無水乙醇中加入0.5-1mg FITC粉末和50-100μL的APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，渦旋攪拌均勻后于搖床中振蕩反應6-8小時后獲得FITC-APTMS(偶聯了APTMS的FITC)，該產物保存于4℃待用；之后，在50mL無水乙醇中加入1-1.5mL去離子水，1.5-2mL 98％TEOS(正硅酸四乙酯)和100-120μL的FITC-APTMS，在緩慢攪拌的條件下滴入3-3.5mL 25％氨水，反應3-3.5小時后加入1mL 98％TEOS，繼續反應三小時；將反應產物以3000-5000轉，15分鐘離心3-5次；每次離心后去除上清，將沉淀分散至3mL無水乙醇中，避光保存。

5.根據權利要求1所述的利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法，其特征在于：所述信號探針為5'-Cy5-CCCTAACCCTAA-3'。

6.根據權利要求1所述的利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法，其特征在于：所述信號探針的制備方法包括：將5'端修飾了Cy5染料的端粒互補序列的粉末離心后加入PBS溶液即獲得10μM的DNA探針溶液。

7.根據權利要求1所述的利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法，其特征在于：所述第一步具體包括如下過程：將1×10⁶個對數生長期的細胞用冰PBS緩沖液離心清洗若干次后分散至100μL RNA酶抑制劑處理過的冰鎮CHAPS裂解液中，冰上孵育一段時間后，將裂解液以12000rpm，20min離心，取出上清即得端粒酶提取物。

8.根據權利要求1所述的利用超分辨成像檢測端粒酶活性的方法，其特征在于：所述端粒酶引物序列為5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3'。