[發明專利]豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒引物組合物及其試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201810489772.4
• 申請日: 2018-05-21
• 公開（公告）號: CN108411040A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 王華南;黃韌;叢鋒;曾繁文;郭鵬舉;王樂烽
• 申請（專利權）人: 浙江大學;廣東省實驗動物監測所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 王海曼

本發明公開了一種豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒引物組合物及其試劑盒和方法；旨在提供一種靈敏度高，特異性強的SADS檢測引物和方法，其技術方案包括由正向內引物SADS?FIP、反向內引物SADS?BIP、正向外引物SADS?F3、反向外引物SADS?B3、正向環引物SADS?LF和反向環引物SADS?LB組成；檢測方法為：1)樣品中提取病毒的RNA；2)以提取的RNA為模板，利用SADS的RT?LAMP引物組合物，建立RT?LAMP擴增體系，在60℃?65℃恒溫條件下進行逆轉錄環介導等溫擴增；3)利用DEAOU?308C恒溫熒光檢測儀檢測；屬于生物檢測技術領域。

技術領域

本發明公開了一種引物組合物，具體地說，是一種檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(SADS)的RT-LAMP引物組合物，本發明還公開了檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的試劑盒和方法；屬于生物檢測技術領域。

背景技術

2016年10月底，廣東清遠一種豬場暴發仔豬致死性疾病，發病仔豬表現為嚴重急性腹瀉、嘔吐、體重迅速下降，5日齡以下的仔豬死亡率高達90％。其他三個豬場隨后也出現了疫情。截至2017年5月，共造成24693頭仔豬死亡。根據臨床癥狀，研究人員對病豬樣本進行了豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒等已知豬腹瀉相關病毒的檢測。然而在疾病暴發高峰期，所有病毒檢測結果均為陰性，表明該疾病是一種新發疾病。隨后，對腸道樣本的高通量測序結果、病毒分離和感染實驗證實，該疾病的病原是一種冠狀病毒，將其命名為豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒，簡稱SADS冠狀病毒(swine acute diarrhea syndromecoronavirus,SADS-CoV)。

對SADS冠狀病毒的基因組序列分析為尋找病毒的來源提供了線索：SADS病毒與2007年香港大學首次發現的蝙蝠冠狀病毒HKU2基因組序列高度相似，全長序列一致性達95％，但囊膜蛋白(S蛋白)的氨基酸序列一致性只有86％。這表明HKU2雖不是SADS冠狀病毒的直接祖先，但兩者在遺傳進化上關系相近，暗示SADS冠狀病毒來源于蝙蝠。研究團隊隨即對2013-2016年期間在廣東采集的591份蝙蝠樣品進行了SADS冠狀病毒特異性定量PCR檢測，共有58份結果為陽性，陽性樣品基本來自菊頭蝠。其中一株在發生疫情豬場附近的蝙蝠洞穴中發現的冠狀病毒與SADS病毒的全基因組序列一致性高達98.48％，其S蛋白氨基酸序列一致性在98％以上。結果進一步表明引起這次仔豬腹瀉疫情的SADS冠狀病毒來源于蝙蝠HKU2相關冠狀病毒的跨種傳播。根據對和病豬有密切接觸的豬場工作人員的血清學調查結果，尚無證據顯示SADS冠狀病毒可進一步跨種感染人。SADS和2002-2003年暴發的嚴重急性呼吸綜合征(SARS)具有諸多相似之處：兩者均發生于廣東，都由新發冠狀病毒引起，源頭都是菊頭蝠。蝙蝠是多種冠狀病毒的自然儲存宿主。SADS冠狀病毒的檢測技術對應該病的疫病防控、保障畜牧業生產安全和流行病學調查具有重要意義。

發明內容

針對上述問題，本發明的第一個目的是提供一種豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒引物組合物；本發明的第二個目的是提供一種靈敏度高的檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的試劑盒，本發明的第三個目的是檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的方法。

為此，本發明提供的第一個技術方案是這樣的：

一種豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒引物組合物，包括由正向內引物SADS-FIP、反向內引物SADS-BIP、正向外引物SADS-F3、反向外引物SADS-B3、正向環引物SADS-LF和反向環引物SADS-LB組成；

引物SADS-F3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

引物SADS-B3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

引物SADS-FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

引物SADS-BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

引物SADS-LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。