[發明專利]豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒引物組合物及其試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201810489772.4
• 申請日: 2018-05-21
• 公開（公告）號: CN108411040A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 王華南;黃韌;叢鋒;曾繁文;郭鵬舉;王樂烽
• 申請（專利權）人: 浙江大學;廣東省實驗動物監測所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 王海曼

1.一種豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒引物組合物，其特征在于，包括由正向內引物SADS-FIP、反向內引物SADS-BIP、正向外引物SADS-F3、反向外引物SADS-B3、正向環引物SADS-LF和反向環引物SADS-LB組成；各引物核苷酸序列如下所示：

引物SADS-F3核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

引物SADS-B3核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

引物SADS-FIP核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

引物SADS-BIP核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

引物SADS-LB核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

引物SADS-LF核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

2.一種檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含權利要求1所述的RT-LAMP引物組合物。

3.一種檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的方法，其特征在于，依次包括下述步驟：

1)從樣品中提取病毒的RNA；

2)以提取的RNA為模板，利用權利要求1)中所述的SADS的RT-LAMP引物組合物，建立RT-LAMP擴增體系，在60℃-65℃恒溫條件下進行環介導等溫擴增；

3)利用DEAOU-308C恒溫熒光檢測儀進行閉管檢測。

4.根據權利要求3所述的一種檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的方法，其特征在于，所述RT-LAMP反應液為：總體積為25μL，反應緩沖液2.5μL；MgSO4 1.5μL；dNTP Mix 3.5μL；Primer mix 1μL；甜菜堿4μL；RNA 2.0μL；Bst 2.0DNA聚合酶1μL；逆轉錄酶0.5μL；SYTO-90.5μL。

5.根據權利要求4所述的一種檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的方法，其特征在于，所述的MgSO4濃度為100mM，dNTP Mix濃度為10mM；甜菜堿濃度為5M；逆轉錄酶濃度為1U/μL；SYTO-9濃度為5mM。

6.根據權利要求4所述的一種檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的方法，其特征在于，所述的Primer mix體系中SADS-OF/SADS-OB、SADS-IF/SADS-IB、SADS-LB的終濃度分別為：0.2mM、1.6mM、0.8mM。

7.根據權利要求3所述的一種檢測豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒的方法，其特征在于，所述環介導等溫擴增程序為63℃擴增1h。