[發(fā)明專利]一種用于凝血酶活性檢測(cè)的質(zhì)譜探針及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810488930.4
• 申請(qǐng)日: 2018-05-21
• 公開（公告）號(hào): CN108707184B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程翼宇;李振皓
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K5/107
• 分類號(hào): C07K5/107;C07K1/107;C07K1/06;C07K1/04;C12Q1/56
• 代理公司: 杭州天勤知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 韓聰

本發(fā)明公開了一種用于凝血酶活性檢測(cè)的質(zhì)譜探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于藥物篩選和評(píng)價(jià)領(lǐng)域。所述的質(zhì)譜探針，包括氨基酸序列為Phe?Pro?Arg?β?Ala的多肽及修飾在所述多肽的β?丙氨酸上的哌嗪類化合物。本發(fā)明提供的質(zhì)譜探針由可被凝血酶特異性識(shí)別的多肽Phe?Pro?Arg?β?Ala與高質(zhì)譜響應(yīng)的小分子哌嗪類化合物連接而成，不僅能被凝血酶特異性識(shí)別并酶切，同時(shí)具有極高的質(zhì)譜響應(yīng)，質(zhì)譜檢測(cè)準(zhǔn)確度高，能夠準(zhǔn)確反應(yīng)凝血酶的活性或凝血酶抑制劑的抑制活性，也非常適用于從中藥等復(fù)雜體系中篩選具有凝血酶抑制活性的化合物。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及藥物篩選和評(píng)價(jià)領(lǐng)域，具體涉及一種用于凝血酶活性檢測(cè)的質(zhì)譜探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

凝血酶(thrombin)屬于絲氨酸蛋白酶家族，在機(jī)體凝血系統(tǒng)中扮演著重要角色，參與凝血過程中的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。凝血酶可促使血漿中的可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白，同時(shí)激活多個(gè)凝血因子，形成血栓。血栓與許多心血管疾病密切相關(guān)，如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死和冠心病等。因此，凝血酶是治療心血管疾病的重要靶點(diǎn)之一，直接凝血酶抑制劑(direct thrombin inhibitor)由于無需輔助因子即可抑制凝血酶，受到了藥物研發(fā)人員的極大重視。

目前使用較為廣泛的直接凝血酶抑制劑包括以水蛭素為代表的二價(jià)抑制劑(主要為多肽類藥物)，以及以阿加曲班為代表的一價(jià)抑制劑(主要為小分子藥物)。此外，從天然產(chǎn)物和傳統(tǒng)中藥中發(fā)現(xiàn)具有凝血酶抑制活性的化合物也是近年來藥物篩選領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

凝血酶抑制劑的篩選離不開相應(yīng)的酶活性檢測(cè)方法。目前，凝血酶活性的檢測(cè)方法主要包括凝血酶滴定法、抗凝法和發(fā)色底物法。

凝血酶滴定法的原理為水蛭素可與凝血酶等比結(jié)合形成不可逆的復(fù)合物，因此在凝固終點(diǎn)通過水蛭素用量即可計(jì)算凝血酶活性。該方法經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)單，易于使用，但重復(fù)性和準(zhǔn)確度較低且易受干擾，很難用于復(fù)雜體系中的藥物篩選。

抗凝法通過血凝儀測(cè)定凝血酶原時(shí)間、凝血酶時(shí)間和促凝血酶原激酶時(shí)間等，需要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，流程較繁瑣。

發(fā)色底物法采用光學(xué)檢測(cè)方法測(cè)定凝血酶/底物反應(yīng)前后的吸光度，專屬性較高，適用于體內(nèi)和體外檢測(cè)，但是，發(fā)色底物法通常采用分光光度法測(cè)定，靈敏度較低，且易受本底的干擾，難以測(cè)定在底物吸收波段有較強(qiáng)吸收的樣品，極大地限制了該方法在天然產(chǎn)物篩選中的應(yīng)用。

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，為了提高蛋白質(zhì)譜離子化的效率，常使用化學(xué)衍生試劑在肽段上修飾特殊的化學(xué)基團(tuán)。如通過在肽段的氨基、羧基或巰基上引入易于離子化的小分子標(biāo)簽，肽段化學(xué)衍生技術(shù)可以顯著提高肽段的靈敏度和專屬性，同時(shí)拓展質(zhì)譜的檢測(cè)范圍。該技術(shù)為設(shè)計(jì)高質(zhì)譜靈敏度的酶底物提供了一種新思路。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種的高質(zhì)譜響應(yīng)的質(zhì)譜探針，作為酶底物，被凝血酶特異性識(shí)別，通過質(zhì)譜測(cè)定酶切反應(yīng)前后的探針或酶切產(chǎn)物的量來檢測(cè)凝血酶的活性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于凝血酶活性檢測(cè)的質(zhì)譜探針，包括氨基酸序列為Phe-Pro-Arg-β-Ala的多肽及修飾在所述多肽的β-丙氨酸上的哌嗪類化合物。

本發(fā)明的質(zhì)譜探針由可被凝血酶特異性識(shí)別的多肽與高質(zhì)譜響應(yīng)的小分子連接而成。所述多肽的氨基酸序列為：苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸-β-丙氨酸(SEQ ID NO.1)，所述的高質(zhì)譜響應(yīng)的小分子為哌嗪類化合物，哌嗪類化合物的-NH與多肽鏈上的β-丙氨酸的羧基縮合。

凝血酶酶切位點(diǎn)為精氨酸與β-丙氨酸之間的酰胺鍵，因此，本發(fā)明質(zhì)譜探針的酶切產(chǎn)物為苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸和β-丙氨酸-哌嗪類化合物。由于哌嗪類化合物具有很強(qiáng)的質(zhì)譜響應(yīng)，因此通過測(cè)定反應(yīng)前后該探針或酶切產(chǎn)物β-丙氨酸-哌嗪類化合物的量，即可檢測(cè)凝血酶的活性。