[發(fā)明專利]一種培養(yǎng)CIK細胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810485909.9
• 申請日: 2018-05-21
• 公開（公告）號: CN108642010A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設計）人: 王歡
• 申請（專利權）人: 王歡
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)CIK細胞的方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A可以激活CIK細胞中顆粒酶B的表達，為有效的顆粒酶B激活劑；顆粒酶B激活劑表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A可以顯著提高CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷力。本發(fā)明還提供了制備表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A的方法，該方法不依賴于反復柱層析，適用于工業(yè)化大規(guī)模制備。現(xiàn)有技術沒有公開過本發(fā)明公開的技術方案。

技術領域

本發(fā)明屬于生物領域，具體涉及CIK細胞的培養(yǎng)及誘導化合物的制備方法。

背景技術

惡性腫瘤嚴重危害人類健康，目前常規(guī)的手術和放化療治療方法均不能徹底清除體內(nèi)的瘤細胞，過繼免疫治療法因具有符合生理、低毒和高效等優(yōu)點成為重要的腫瘤輔助治療手段。其中，細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-inducedkillercells，CIK細胞)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非常有前景的過繼免疫細胞，具有增殖迅速、殺瘤活性廣譜且高效、毒副作用微小等優(yōu)點，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療領域的一種新選擇。CIK是以CD3+CD56+T細胞為主的異質(zhì)細胞群，兼有NK細胞和T細胞的特征。在功能上，CIK一方面擁有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，另一方面還擁有NK細胞非MHC限制性的殺傷腫瘤的特點，其增殖迅速、對正常造血影響輕微。CIK細胞的增殖和細胞毒活性依賴于多種外源性細胞因子的刺激，但何種因子組合為最佳尚無定論，因此研究如何進一步提高CIK的增殖和殺瘤活性已經(jīng)成為抗腫瘤的過繼免疫細胞生物治療的一個熱點(參考文獻：黃招琴等，卡介菌多糖核酸對CIK細胞活性的影響，湖南師范大學自然科學學報，2017年3月第40卷第2期)。

顆粒酶B是殺傷性T淋巴細胞和NK細胞顆粒中最重要的絲氨酸蛋白酶，通過Caspases依賴途徑、直接入核途徑及不依賴Caspases的胞質(zhì)途徑殺傷靶細胞，顆粒酶B的表達水平直接關系到CIK細胞對腫瘤的殺傷力(參考文獻：PrakashMD,BirdCH,BirdPI.Activeand zymogen forms of granzyme B are constitutively released from cytotoxiclymphocytes in the absence of target cell engagement,ImmunolCellBiol.2009)。

因此，如果能尋找到促進CIK細胞顆粒酶B表達水平的誘導化合物，就可以用于CIK細胞培養(yǎng)提高CIK細胞對腫瘤細胞的殺傷力。

表原莪術烯醇(CAS登錄號127214-97-5)、莪術烯醇(CAS登錄號19431-84-6)、苦蘵內(nèi)酯A(CAS登錄號146713-98-6)、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A(CAS登錄號120824-03-5)的化學信息如圖1所示。目前沒有現(xiàn)有技術道過表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A可以存進CIK細胞顆粒酶B的表達。

另外，目前制備表原莪術烯醇、莪術烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F、魏察苦蘵素A的方法步驟復雜，依賴于反復柱層析，不適用于規(guī)模化制備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種CIK細胞的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明通過下面的技術方案得以實現(xiàn)的：

一種CIK細胞的培養(yǎng)方法，包括：

取外周抗凝血100mL，加入淋巴細胞分離液，1500rpm離心15min，吸取單個核細胞層，用生理鹽水洗滌3次，每次1500rpm離心10min；最后一次離心后重懸細胞，按細胞數(shù)5×10⁶個/mL加含有500μg/LCD3mAB、1000U/mLIL-2和10％FBS的GT-T551培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)成CIK細胞，每隔2～3d半量換液。