[發(fā)明專利]一種提高CIK細(xì)胞殺瘤活性的培養(yǎng)方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810485905.0
• 申請日: 2018-05-21
• 公開（公告）號: CN108642009A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王歡
• 申請（專利權(quán)）人: 王歡
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種提高CIK細(xì)胞殺瘤活性的培養(yǎng)方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，表原莪術(shù)烯醇、莪術(shù)烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A可以激活CIK細(xì)胞中顆粒酶B的表達(dá)，為有效的顆粒酶B激活劑；顆粒酶B激活劑表原莪術(shù)烯醇、莪術(shù)烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A可以顯著提高CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。本發(fā)明還提供了制備表原莪術(shù)烯醇、莪術(shù)烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A的方法，該方法不依賴于反復(fù)柱層析，適用于工業(yè)化大規(guī)模制備。現(xiàn)有技術(shù)沒有公開過本發(fā)明公開的技術(shù)方案。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及CIK細(xì)胞的培養(yǎng)及誘導(dǎo)化合物的制備方法。

背景技術(shù)

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，目前常規(guī)的手術(shù)和放化療治療方法均不能徹底清除體內(nèi)的瘤細(xì)胞，過繼免疫治療法因具有符合生理、低毒和高效等優(yōu)點(diǎn)成為重要的腫瘤輔助治療手段。其中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells，CIK細(xì)胞)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非常有前景的過繼免疫細(xì)胞，具有增殖迅速、殺瘤活性廣譜且高效、毒副作用微小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一種新選擇。CIK是以CD3+CD56+ T細(xì)胞為主的異質(zhì)細(xì)胞群，兼有NK細(xì)胞和T細(xì)胞的特征。在功能上，CIK一方面擁有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，另一方面還擁有NK細(xì)胞非MHC限制性的殺傷腫瘤的特點(diǎn)，其增殖迅速、對正常造血影響輕微。CIK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒活性依賴于多種外源性細(xì)胞因子的刺激，但何種因子組合為最佳尚無定論，因此研究如何進(jìn)一步提高CIK的增殖和殺瘤活性已經(jīng)成為抗腫瘤的過繼免疫細(xì)胞生物治療的一個(gè)熱點(diǎn)(參考文獻(xiàn)：黃招琴等，卡介菌多糖核酸對CIK細(xì)胞活性的影響，湖南師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2017年3月第40卷第2期)。

顆粒酶B是殺傷性T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞顆粒中最重要的絲氨酸蛋白酶，通過Caspases依賴途徑、直接入核途徑及不依賴Caspases的胞質(zhì)途徑殺傷靶細(xì)胞，顆粒酶B的表達(dá)水平直接關(guān)系到CIK細(xì)胞對腫瘤的殺傷力(參考文獻(xiàn)：Prakash MD,Bird CH,BirdPI.Active and zymogen forms of granzyme B are constitutively released fromcytotoxic lymphocytes in the absence of target cell engagement,Immunol CellBiol.2009)。

因此，如果能尋找到促進(jìn)CIK細(xì)胞顆粒酶B表達(dá)水平的誘導(dǎo)化合物，就可以用于CIK細(xì)胞培養(yǎng)提高CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷力。

表原莪術(shù)烯醇(CAS登錄號127214-97-5)、莪術(shù)烯醇(CAS登錄號19431-84-6)、苦蘵內(nèi)酯A(CAS登錄號146713-98-6)、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A(CAS登錄號120824-03-5)的化學(xué)信息如圖1所示。目前沒有現(xiàn)有技術(shù)道過表原莪術(shù)烯醇、莪術(shù)烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F和魏察苦蘵素A可以存進(jìn)CIK細(xì)胞顆粒酶B的表達(dá)。

另外，目前制備表原莪術(shù)烯醇、莪術(shù)烯醇、苦蘵內(nèi)酯A、苦蘵內(nèi)酯F、魏察苦蘵素A的方法步驟復(fù)雜，依賴于反復(fù)柱層析，不適用于規(guī)模化制備。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種CIK細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括：

取外周抗凝血100mL，加入淋巴細(xì)胞分離液，1500rpm離心15min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，用生理鹽水洗滌3次，每次1500rpm離心10min；最后一次離心后重懸細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)5×10⁶個(gè)/mL加含有500μg/L CD3 mAB、1000U/mL IL-2和10％FBS的GT-T551培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)成CIK細(xì)胞，每隔2～3d半量換液。