[發(fā)明專利]一種封閉探針介導的ARMS-ddPCR檢測基因突變的試劑盒

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• 申請日: 2018-05-20
• 公開（公告）號: CN109112187A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發(fā)明（設計）人: 祝令香;彭志勇;郭永;王勇斗
• 申請（專利權）人: 北京天健惠康生物科技有限公司;清華大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明提供一種封閉探針介導的ARMS?ddPCR檢測基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括：ARMS引物，與ARMS引物配對進行PCR擴增的下游引物或上游引物，野生型封閉探針，和檢測探針。本發(fā)明的封閉探針與ARMS引物方向相同，封閉探針與ARMS引物在模板結合區(qū)有重疊或者封閉探針不能被水解，從而達到封閉ARMS引物對野生型模板的非特異性擴增的效果。

技術領域

本發(fā)明涉及微液滴數字PCR技術領域，具體涉及一種封閉探針介導的ARMS-ddPCR檢測基因突變的試劑盒。

背景技術

等位基因特異性PCR(ARMS-PCR)已在多個文獻和專利中進行描述，已知引物3’末端核苷酸是區(qū)分是否與目標序列完全匹配的核苷酸，但該核苷酸并不能完全決定擴增特異性，等位基因特異性PCR中的特異性主要是錯配引物遠遠低于完全匹配引物的延伸速度，從而降低了錯配目標的相對擴增效率。但該過程是動態(tài)平衡的，降低的延伸動力學及由此而來的PCR擴增特異性還受其他許多因素影響：包括酶的錯配堿基識別能力、反應組分、退火延伸溫度及引物全部序列背景。這些因素對每一個具體引物的影響都可能不相同，無法定量估計。因此，等位基因特異性PCR引物的設計存在很多不確定性，需要大量的反復實驗。為了提高擴增特異性，也有報道在除了3’末端核苷酸之外的其他序列位置人為引入錯配堿基，從而降低非特異擴增；或者通過引入某些核苷酸的化學修飾來降低非特異性擴增。但這些人工錯配堿基或額外的化學修飾在提高擴增特異性的同時，可能會降低完全匹配引物的擴增效率，造成檢測靈敏度下降。

隨著數字PCR發(fā)展，基于微液滴的數字PCR技術(ddPCR)在稀有突變檢測中凸顯出極大優(yōu)勢，該技術基于微流控芯片，可生成數微米到數百微米的液滴，液滴的體積通常為皮升到納升級別，可以包裹單分子。為了便于生化反應，微液滴可以是惰性油通過生物相容性的表面活性劑包裹水相的形式。微液滴可以看作皮/納升尺度的試管，常見的生物化學可以在微液滴中實現。ddPCR獨特的優(yōu)勢如下：(1)靈敏度高，一個液滴可包含單個分子或細胞，在物理層面實現單分子級檢測；(2)準確性強，每次微流體芯片可生成數百萬個微液滴，對逐個微液滴統(tǒng)計，通過泊松分布計算模板數量，可實現數字化，結論可靠；(3)反應全封閉，生化反應局限于惰性油包裹的水相中，不會對下次反應造成污染；(4)全集成，微液滴的生成、融合、注射、分割、計數、分選、檢測都是在流體運動中，易于集成；(5)試劑成本低，每次皮升級的進樣量可節(jié)省昂貴的生物試劑。目前，基于微液滴技術的研究工作和各種應用領域發(fā)表在Cell、Nature、Nature Biotechnology、PNAS等高水平雜志上。可以預見，隨著檢測技術的不斷改進，敏感性和特異性的不斷提高，微液滴技術將在核酸檢測和分子診斷領域發(fā)揮巨大的應用價值。

近年來，肺癌仍是威脅人類健康的首要惡性腫瘤。據WHO報道，全球肺癌新發(fā)病例約161萬例，死亡約138萬例，分別占惡性腫瘤新發(fā)病例及死亡病例的13％及18％，居惡性腫瘤第一位，其中非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)占肺癌的80％以上。盡管肺癌的診斷方法和治療手段不斷提高，肺癌的死亡率仍未得到有效控制，患者的預后較差，5年生存率仍<20％。我國肺癌發(fā)病率和死亡率持續(xù)高居首位，每年新增肺癌病例約73萬，嚴重危害大眾健康。隨著個體化醫(yī)療觀念的不斷深入，精準醫(yī)療正逐漸成為腫瘤治療的新方向，檢測特定基因突變可以為醫(yī)生的個體化診療提供靶向用藥的參考。受體酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是近年來肺癌治療的熱點靶向藥物，與傳統(tǒng)放化療藥物相比，靶向藥可明顯延長腫瘤患者生存期，改善生存質量。

研究表明，表皮細胞生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制物(TKI)吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼等被證明對具有EGFR激活突變的晚期非小細胞肺癌(NSCLC)患者具有顯著療效，EGFR-TKI成為非小細胞肺癌靶向治療的里程碑。當EGFR酪氨酸激酶區(qū)(tyrosine kinase，TK)發(fā)生突變時，可使酪氨酸激酶抑制劑治療晚期NSCLC患者的有效率達到80％以上。