[發明專利]一種胎兒染色體非整倍體檢測中DNA的檢測及質控方法

在審

• 申請號: 201810484123.5
• 申請日: 2018-05-19
• 公開（公告）號: CN108642161A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 楊瑤;余艷
• 申請（專利權）人: 長沙金域醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6804;C40B50/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種胎兒染色體非整倍體檢測中DNA的檢測及質控方法，其特征在于，包括：

步驟A：樣本采集、保存及質控；

步驟B：DNA提取；

步驟C：文庫構建；

步驟D：文庫濃度測定及保存；

步驟E：上機測序；

步驟F：結果分析；

其中，所述步驟A包括：

樣本采集：采血管一采集5.0mL孕婦外周血，采集完畢后，輕柔顛倒采血管并及時將采血管放置冰箱中；采血管二采集10.0mL孕婦外周血，采集完畢后，輕柔顛倒采血管并常溫保存；預冷低速離心機至溫度穩定后，放入采血管二，離心分鐘，吸取上清血漿，轉移至置于冰盒上的2.0mLEP管中，標記相應的樣品編號；預冷高速離心機至溫度穩定后，放入上步所得2.0mLEP管并離心，槍頭對著非白細胞沉淀處，在冰盒上吸取上清血漿，分裝至置于冰盒上的1.5mLEP管中，每管轉入400uL血漿，標記樣品編號和血漿管數，立即放入冰箱中保存；對該保存的樣品進行質控和處理。

2.根據權利要求1所述的胎兒染色體非整倍體檢測中DNA的檢測及質控方法，其特征在于，所述步驟C包括：

步驟a：對樣本DNA進行物理打斷，得到片段化DNA溶液；

步驟b：對所述片段化DNA進行末端修復及磁珠純化，得到純化好的平末端DNA；

步驟c：對所述平末端DNA進行接頭連接，得到連接接頭的DNA；

步驟d：對所述連接接頭的DNA進行PCR擴增，得到文庫；

其中，所述步驟c具體包括：

在離心管中依次加入平末端DNA、無核酸酶水、連接緩沖液、dNTP、DNA連接酶、P1接頭和標簽序列X并混勻，反應后加入磁珠吹打混勻，靜置5分鐘；

將離心管放置在磁力架上，待磁珠吸附完全溶液變澄清之后吸去上清；加入75％乙醇，轉動離心管，溶液澄清后吸去上清；

取下離心管，離心數秒后將離心管置于磁力架上，待磁珠吸附完全之后吸去殘留溶液，敞開管蓋，室溫晾干；

加入TE溶液，吹打混勻后靜置；瞬時離心后將離心管置于磁力架上靜置至溶液澄清，將管內液體轉移至PCR管，得到連接接頭的DNA。

3.根據權利要求2所述的胎兒染色體非整倍體檢測中DNA的檢測及質控方法，其特征在于，所述步驟D包括：

步驟D1：稀釋待測樣品，準備標準品，并將兩者都低溫保存；

步驟D2：取離心管，在管蓋上做好標記，按照下表中的反應體系配制反應混合液，配制時按照每個樣品做2次重復反應所需的量配制體系，反應混合液包括定量擴增試劑、無核酸酸酶水、P1引物和P2引物，配制完成后，將反應混合液振蕩，瞬時離心至管底；

步驟D3：將所述步驟D2中配好的反應混和液加到反應板的各反應管孔中，向標準品反應孔中分別加入2L的標準品，每個反應板同時設置無模板對照反應孔，孔中加入2uL無核酸酶水；

步驟D4：使用封膜工具和光學粘性膜密封所述反應板，使用離心機離心反應板，將反應板裝載到熒光定量PCR擴增儀并進行設置后開始運行qPCR反應，得到文庫濃度測定結果。

4.根據權利要求3所述的胎兒染色體非整倍體檢測中DNA的檢測及質控方法，其特征在于，所述步驟D4中設置程序具體包括：

步驟1：在Plate Setup界面，選好標準品孔和樣本孔，重復系數均為2；

步驟2：在熒光定量PCR擴增儀上設置程序：先95℃1分鐘；后95℃15秒，65℃15秒，72℃30秒循環30次；再后95℃15秒，65℃1分鐘，95℃15秒；

步驟3：在Melting Curve Stage階段中設置“65℃1分鐘，95℃15秒”，65℃到95℃的升溫過程中設置收集熔解曲線，如有收集熔解曲線方式選項，則選擇Step and hold方式；

步驟4：設置反應體系為20uL，單擊RUN開始進行qPCR反應。