[發明專利]PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法

在審

• 申請號: 201810482548.2
• 申請日: 2018-05-18
• 公開（公告）號: CN108642071A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 王清路
• 申請（專利權）人: 山東百福基因科技有限公司;王清路
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種PD?1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法。PD?1和CTLA4雙基因敲除載體的構建，T淋巴細胞分離與激活，電轉染T淋巴細胞及T7E1酶切鑒定，流式細胞儀篩選與測序分析。本發明的基因缺陷型免疫細胞制劑的生產，一方面簡化了細胞的生產程序，另一方面提升了T淋巴細胞殺滅腫瘤細胞的能力，并能增強長期腫瘤免疫。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法。

背景技術

T細胞主要識別由細胞表面主要組織相容性復合物(MHC)提呈的抗原肽。大多數情況下，T細胞表面抗原受體(TCR)信號轉導可以活化抗原激活的T細胞，然而，僅僅依靠TCR信號轉導途徑難以觸發T細胞免疫應答。因此，T細胞的有效活化和功能介導需要雙重信號的協同作用：一是抗原肽-MHC復合物，由T細胞抗原受體(TCR)識別；二是協同刺激信號，由抗原遞呈細胞(APC)和T細胞表面的協同刺激分子配體和受體對提供。其中，PD-1/PD-L1是公認的最基本的協同刺激信號，由表達在T細胞上的PD-1和表達在抗原遞呈細胞表面的PD-L1和PD-L2相互作用產生。PD-1(programmed death-1)，又稱為PDCDl、CD279，是CD28免疫球蛋白超家族中的一員，它是在誘導T細胞雜交瘤發生凋亡時發現并命名的，主要表達在外周循環T細胞、自然殺傷細胞(NKT)，B細胞和單核細胞上。PD-1分子有兩個配體PD-L1(又稱CD274)和PD-L2(又稱CD273)，它們均為B7家族成員。PD-1與其配體PD-L1相結合可對機體免疫系統起負性調節作用。腫瘤免疫應答早期，循環免疫細胞T細胞可以識別、浸潤繼而清除某些癌細胞，然而，一些癌細胞可以通過某些方式逃過免疫監視和免疫系統介導的細胞死亡。研究表明，共刺激分子PD-1，與其配體PD-L1相互作用可以降低免疫應答的強度和持續時間，這為癌細胞的免疫逃逸提供了有利條件。體外研究表明阻斷PD-1/PD-L1途徑可以增強T細胞免疫效能，調節機體抗腫瘤免疫應答。目前認為共刺激分子及其調節途徑在癌細胞抗腫瘤免疫過程中發揮了極其重要的作用。阻斷PD-1/PD-L1通路能有效促進腫瘤特異性CD8+ T細胞對腫瘤組織的浸潤，分泌大量腫瘤殺傷因子，從而抑制腫瘤的生長。

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(CTLA-4)又稱CD125分子，是一種免疫調節分子，是B7分子配體，屬于免疫球蛋白超家族的抑制分子，其結合后誘導T細胞參與免疫反應負調節，即誘導T細胞無反應，使T細胞的細胞周期停滯于Gl期等，抑制T淋巴細胞的增殖和功能。研究表明，用抗體阻斷CTLA4功能可顯著增加T淋巴細胞的激活。抗腫瘤T淋巴細胞在機體對惡性腫瘤的免疫監視中起關鍵作用。實驗顯示，給移植了腫瘤的小鼠注射抗CTLA4抗體可抵制多種類型的腫瘤并可長期保持抗腫瘤免疫。臨床研究表明阻斷CTLA4可使腫瘤縮小。這些資料都表明CTLA4在腫瘤的發生發展中起重要作用。

因此，采用CRISPR/Cas9技術敲除T淋巴細胞中的PD-1基因，從而激活T淋巴細胞對腫瘤細胞攻擊的能力，實現腫瘤的免疫治療，敲除CTLA4更有利于T淋巴細胞的激活，并能使細胞獲得長期的抗腫瘤免疫，雙缺陷基因的T淋巴細胞更具有殺滅腫瘤細胞的能力。

發明內容

本發明的目的是提供一種PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法，簡化了細胞的生產程序、提升了T淋巴細胞攻擊腫瘤細胞的能力，并能增強長期腫瘤免疫。

本發明所述的PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法，步驟如下：

(1)PD-1和CTLA4雙基因敲除載體的構建

根據PD-1和CTLA4全基因序列(外顯子區)分別設計gRNA target序列，然后將兩個gRNA target序列克隆進表達載體，獲得帶有兩個不同target序列gRNA的敲除載體；