[發明專利]PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法

在審

• 申請號: 201810482548.2
• 申請日: 2018-05-18
• 公開（公告）號: CN108642071A
• 公開（公告）日: 2018-10-12
• 發明（設計）人: 王清路
• 申請（專利權）人: 山東百福基因科技有限公司;王清路
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法，其特征在于步驟如下：

(1)PD-1和CTLA4雙基因敲除載體的構建

根據PD-1和CTLA4全基因序列分別設計gRNA target序列，然后將兩個gRNA target序列克隆進表達載體，獲得帶有兩個不同target序列gRNA的敲除載體；

兩個gRNA target序列分別為5’-GGAGTGGATAGGCCACGGCG-3’和5’-ACACCGCTCCCATAAAGCCA-3’；

(2)T淋巴細胞分離與激活

T淋巴細胞分離，培養，激活，繁殖，收集；

(3)電轉染T淋巴細胞及T7E1酶切鑒定

T淋巴細胞中加入電轉液和步驟(1)得到的敲除載體進行電轉染，電轉染結束后，繼續培養，收集細胞提取基因組，采用T7E1酶切鑒定；

(4)流式細胞儀篩選與測序分析

電轉染結束后收集的細胞采用流式細胞儀進行分離得到單克隆細胞，單克隆細胞擴大培養，即得PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑；擴大培養后的單克隆細胞提取基因組進行測序分析。

2.根據權利要求1所述的PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的表達載體為p2U6gRNA-Cas9-GFP表達載體。

3.根據權利要求1所述的PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的電轉液組成如下，以體積百分比計：

無鈣鎂PBS 90％

無血清培養基RPMI 1640 10％；

以無鈣鎂PBS和無血清培養基RPMI 1640的總體積為100％計，EDTA加入量為30g/L，蔗糖加入量為200mmol/L。

4.根據權利要求1所述的PD-1和CTLA4雙基因缺陷型T淋巴細胞制劑的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的繼續培養時間為48h。