[發(fā)明專利]劍麻PGIP基因及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810480427.4
• 申請(qǐng)日: 2018-05-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108642063B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張燕梅;周文劍;王瑞芳;楊子平;鹿志偉;李俊峰;陸軍迎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12Q1/6895
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司 44228
• 代理人: 李慧

本發(fā)明采用PCR的方法，克隆了2個(gè)劍麻PGIP基因，AhPGIP1和AhPGIP2；AhPGIP1全長(zhǎng)為1008bp，蛋白分子量約為36.7kD，等電點(diǎn)為8.65；AhPGIP2全長(zhǎng)為981bp；通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)初步證實(shí)PGIP基因可提高劍麻和煙草對(duì)煙草疫霉的抗性，既為劍麻遺傳改良提供了基因資源和理論依據(jù)，又為其它作物抗病相關(guān)遺傳改良提供了基因資源和理論依據(jù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于現(xiàn)有的核酸序列，克隆劍麻PGIP基因，并分別利用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和瞬時(shí)表達(dá)方法對(duì)PGIP基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)和功能進(jìn)行研究，屬于植物分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIPs）是一類與植物自身免疫相關(guān)的多功能蛋白，含有10 個(gè)不完整的 e LRR，每一個(gè) e LRR 由 24 個(gè)殘基組成，且氨基酸序列通常為 LxxLxx Lx Lxx Nx Lt/sgx。其作用機(jī)制是通過(guò)抑制病原真菌PGs 活性，減少PGs對(duì)植物細(xì)胞壁的傷害，同時(shí)通過(guò)PGs和PGIPs的相互作用促進(jìn)寡聚半乳糖醛酸苷的形成，激發(fā)一系列的防御反應(yīng)，從而提高植物對(duì)病原菌的抗性，在植物防衛(wèi)反應(yīng)中扮演著重要角色。截止2015年，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)公布了170多個(gè)PGIP基因的全長(zhǎng)或部分序列，前人研究表明超表達(dá)自身或外源PGIP基因，可提高植物對(duì)病原物的抗性，并且在番茄、馬鈴薯、水稻、小麥、擬南芥、葡萄、蘋果、油菜、菜心、煙草、豌豆以及蘋果等植物中都有報(bào)導(dǎo)，而沉默PGIP基因則增加植物對(duì)病原菌的敏感性。因此，該基因在植物抗病相關(guān)遺傳改良中有十分重要的作用。

劍麻是我國(guó)熱區(qū)特有的經(jīng)濟(jì)作物之一，劍麻不僅是主要的熱帶纖維原料，劍麻莖心是釀造龍舌蘭酒的主要原料，劍麻麻渣含有較高皂素，可用來(lái)制藥，劍麻也是一種重要的生物質(zhì)能源，并且近年來(lái)，劍麻作為景天庚代謝的模式植物，有非常重要的理論和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。斑馬紋病是劍麻的主要病害之一，由于斑馬紋病的發(fā)生導(dǎo)致劍麻產(chǎn)業(yè)嚴(yán)重受損，盡管生產(chǎn)上形成了一套預(yù)防斑馬紋病的防治方面，但目前關(guān)于斑馬紋病的致病機(jī)理和抗病機(jī)制仍不清楚，而且生產(chǎn)上短期內(nèi)也沒(méi)有抗斑馬紋病的新品種可替代。因此，通過(guò)基因工程手段對(duì)現(xiàn)有品種遺傳改良成了首選方法之一。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中，對(duì)不同發(fā)病時(shí)期的斑馬紋病易感和高抗品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)PGIP基因受煙草疫霉誘導(dǎo)表達(dá)顯著上調(diào)，且在抗/感品種間表達(dá)差異顯著，暗示PGIP在劍麻抗斑馬紋病中發(fā)揮重要作用，因此克隆劍麻PGIP基因并在劍麻和煙草中瞬時(shí)表達(dá)，既為利用基因工程技術(shù)開(kāi)展劍麻及其它作物抗病相關(guān)遺傳改良提供基因資源，又為劍麻遺傳改良提供了理論和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供2個(gè)劍麻PGIP基因及其序列，并同時(shí)提供2個(gè)劍麻PGIP基因特異性擴(kuò)增引物，熒光定量PCR引物和內(nèi)參基因GAPDH的特異性引物，建立基于SYBR Green熒光染料技術(shù)的qRT-PCR方法，構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體，一方面為利用基因工程技術(shù)開(kāi)展劍麻及其它作物抗病相關(guān)遺傳改良提供基因資源，另一方面為劍麻煙草疫霉侵染、低溫脅迫、鹽脅迫、傷處理、水楊酸和茉莉酸甲酯等逆境條件下基因表達(dá)分析提供穩(wěn)定可靠的內(nèi)參基因和技術(shù)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本方法采用的技術(shù)方案是：

劍麻PGIP基因及其應(yīng)用，包括如下內(nèi)容：

1. 植物材料：用于傷處理和煙草疫霉接種（煙草疫霉脅迫和瞬時(shí)表達(dá)）的為2年生的H.11648盆栽苗，用于低溫、鹽（NaCl）脅迫、水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)處理的為8-10cm的H.11648組培苗。用于瞬時(shí)表達(dá)的煙草為2-3月生的本氏煙實(shí)生苗。

2. 處理?xiàng)l件：低溫處理溫度為4℃，鹽脅迫的NaCl濃度為200mM，水楊酸(SA)的處理濃度為10mM，茉莉酸甲酯(MeJA)的處理濃度為1mM。煙草疫霉接種后的取樣時(shí)間分別0h，24h, 36h, 48h和72h；低溫，傷，鹽、SA和MeJA處理后的取樣時(shí)間分別為0h, 3h, 6h, 12h和24h。