[發(fā)明專利]一種抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基及間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810473489.2
• 申請日: 2018-05-17
• 公開（公告）號: CN108611320A
• 公開（公告）日: 2018-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖立;帥逸;趙宇;鄧志宏
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東芙金干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
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本發(fā)明公開了一種抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基及間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。該抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基包括：低糖α?MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、miR?705 antagomir、維生素C、谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素。該抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基能夠延緩長期體外傳代擴增所致的間充質(zhì)干細(xì)胞衰老和功能下降。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明實施例涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基及間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）是存在于骨髓中的一群間充質(zhì)干細(xì)胞，具有很強的克隆形成能力及自我更新能力。高表達間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞表面標(biāo)志CD29，CD73及CD105，擁有多向分化潛能，能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。現(xiàn)在研究普遍認(rèn)為，BMSC在骨組織的發(fā)育及修復(fù)再生中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。BMSC是成骨前體細(xì)胞的來源，直接參與骨發(fā)育、改建、修復(fù)及再生。在骨改建過程中，BMSC向骨吸收處遷移，并通過向成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞分化，形成新骨。在骨折及骨缺損發(fā)生后，BMSC能夠被迅速動員并向局部組織遷移，促進骨組織的再生修復(fù)。因為MSC的強大再生修復(fù)功能，已被廣泛運用于組織工程骨的構(gòu)建和骨缺損修復(fù)中。

大段骨缺損修復(fù)需要的細(xì)胞量巨大，而通過骨髓分離培養(yǎng)的原代BMSC數(shù)量有限，所以BMSC必須在體外進行長期擴增才能滿足臨床治療需要。但是最新研究顯示，在細(xì)胞長期多次傳代擴增過程中，BMSC會出現(xiàn)相應(yīng)的老化現(xiàn)象，表現(xiàn)為自我更新能力的降低和成骨分化能力顯著下降，導(dǎo)致其骨再生和修復(fù)能力降低。如何避免BMSC在體外長期傳代過程中的衰老已成為制約其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵瓶頸。

microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的單鏈、非編碼小RNA，在BMSC成骨分化中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。現(xiàn)有技術(shù)中，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達水平的改變可導(dǎo)致BMSC分化功能缺陷，引起多種骨疾病發(fā)生。經(jīng)過前期多項研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞衰老過程中，BMSC的miRNA表達譜發(fā)生了顯著改變，并證實其中miR-705的表達異常，是造成BMSC功能下降的重要原因。那么，如何解決BMSC功能下降成為當(dāng)前亟需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基及間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，能夠延緩長期體外傳代擴增所致的間充質(zhì)干細(xì)胞衰老和功能下降。

第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括：

低糖α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、miR-705 antagomir、維生素C、谷氨酰胺、青霉素和鏈霉素。

進一步地，培養(yǎng)基按1升計，包括：

低糖α-MEM培養(yǎng)基 880毫升ml、胎牛血清100ml、miR-705 antagomir 10微克μg、維生素C 10毫克mg、谷氨酰胺 2毫摩爾mmol、青霉素 10ml和鏈霉素10ml。

進一步地，培養(yǎng)基還包括：兩性霉素。

第二方面，本發(fā)明實施例還提供了一種間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，應(yīng)用具有上述第一方面中任意一項特征的抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基，該方法包括：

步驟一、間充質(zhì)干細(xì)胞分離：獲取骨髓，并加入等體積的磷酸鹽緩沖液稀釋骨髓，加入單核細(xì)胞分離液，收集單核細(xì)胞；

步驟二、間充質(zhì)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)：將單核細(xì)胞重懸于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

步驟三、間充質(zhì)干細(xì)胞的前期傳代培養(yǎng)：待單核細(xì)胞增殖至75%-80%密度時，吸盡基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的培養(yǎng)基，傳代，繼續(xù)用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)；

步驟四、間充質(zhì)干細(xì)胞的后期傳代培養(yǎng)：待單核細(xì)胞培養(yǎng)至第五代之后，用抗衰老的干細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

進一步地，步驟一，具體包括：