[發(fā)明專利]一種皮張中古DNA的提取方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810465329.3
• 申請(qǐng)日: 2018-05-16
• 公開（公告）號(hào): CN108410861B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付巧妹;曹鵬;戴情燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院古脊椎動(dòng)物與古人類研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京路勝元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11669
• 代理人: 羅巍;路兆強(qiáng)

本發(fā)明涉及一種皮張中古DNA的提取方法，包括樣品預(yù)處理步驟、消化蛋白步驟、吸附步驟及洗脫步驟；所述消化蛋白步驟采用proteinK/EDTA消化液，所述protein K/EDTA消化液為包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；所述吸附步驟采用的吸附體系包含Binding buffer、乙酸鈉溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸鈉的混合液中的帶濾膜的吸附柱；所述Binding buffer為包含鹽酸胍、異丙醇或無水乙醇、Tween20的水溶液；所述濾膜為硅基質(zhì)濾膜；所述洗脫步驟采用TET洗脫液，所述TET洗脫液是包含三羥甲基氨基甲烷?HCl、EDTA、Tween 20的水溶液。本發(fā)明方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，在古皮張樣品相同情況下，可獲得現(xiàn)有技術(shù)12倍以上DNA分子總量，因此可用更少的皮張樣品用量，提取效率更高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種DNA的提取技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種古DNA的提取方法及試劑盒。

背景技術(shù)

古DNA是指保存于古生物遺骸中的遺傳物質(zhì)。隨著分子生物學(xué)的出現(xiàn)，古DNA研究也逐漸進(jìn)入了考古工作者的視野，為現(xiàn)代與古代生物間譜系發(fā)育關(guān)系提供直接證據(jù)，同時(shí)也為研究人類起源與遷徙、動(dòng)植物的家養(yǎng)與馴化以及農(nóng)業(yè)文明的起源和早期發(fā)展等問題提供一個(gè)新視角。然而，古DNA的成功提取一直是其中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。這主要是由于受保存時(shí)間和保存狀態(tài)的影響，古DNA的含量相對(duì)較低且極易受有機(jī)物質(zhì)污染降及解。在此基礎(chǔ)上，針對(duì)古DNA的提取技術(shù)也受到了各種制約，提取的成功與否很大程度上決定了研究的深度和廣度。據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，考古遺址中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物毛皮，這對(duì)研究古代動(dòng)物與現(xiàn)代動(dòng)物之間的遺傳關(guān)系，揭示家養(yǎng)動(dòng)物的起源與馴化具有重要意義，而考古現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)或博物館保存的皮張又因長時(shí)間的降解影響，進(jìn)一步加大了提取難度。

皮張古DNA提取技術(shù)可為珍稀動(dòng)物保護(hù)遺傳學(xué)研究提供基礎(chǔ)。目前，絕大部分珍稀瀕危動(dòng)物的種群生存狀況已相當(dāng)脆弱，已不允許破壞性取樣，因此利用館藏標(biāo)本樣品用于保護(hù)遺傳學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化等方面的研究成為解決這一難題的重要途徑。雖已有學(xué)者從館藏陳舊皮張標(biāo)本中成功提取了DNA，但因陳舊皮張中DNA相對(duì)含量低及污染問題，使這些方法往往存在著標(biāo)本樣品用量大、提取效果差、實(shí)驗(yàn)周期長和操作步驟繁瑣等不足。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種新的皮張中古DNA的提取方法及試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)提取時(shí)皮張樣品用量少、DNA污染低、提取效率高、操作時(shí)間短、操作簡單、內(nèi)源DNA獲取量較大等目標(biāo)，從而為考古學(xué)研究、珍稀動(dòng)物保護(hù)研究和其他相關(guān)領(lǐng)域研究提供了技術(shù)保障和支持。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要通過選擇使用高效的消化液和吸附緩沖液(DNAbinding Buffer)，獲取更多的古DNA信息，尤其是不易捕獲的短片段DNA信息。由此，既避免了古DNA的污染問題，同時(shí)又能高效、便捷地獲得含有古DNA的溶液。

本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案如下：

一種皮張中古DNA的提取方法，其包括：樣品預(yù)處理步驟、消化蛋白步驟、吸附步驟及洗脫步驟；其中：

所述消化蛋白步驟采用protein K/EDTA消化液，所述protein K/EDTA 消化液為包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；

所述吸附步驟采用的吸附體系包含Binding buffer、乙酸鈉溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸鈉的混合液中的帶濾膜的吸附柱；所述Binding buffer為包含鹽酸胍、異丙醇或無水乙醇、Tween 20的水溶液；所述濾膜為硅基質(zhì)濾膜；

所述洗脫步驟采用TET洗脫液，所述TET洗脫液是包含三羥甲基氨基甲烷-HCl、EDTA、Tween 20的水溶液。

優(yōu)選地，所述protein K/EDTA消化液中，所述protein K/EDTA消化液中，蛋白酶K的濃度為0.20mg/mL～40mg/mL，EDTA濃度為 0.40mol/L～0.60mol/L，Tween20的體積分?jǐn)?shù)為0.03～0.08％。