[發明專利]一種皮張中古DNA的提取方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201810465329.3
• 申請日: 2018-05-16
• 公開（公告）號: CN108410861B
• 公開（公告）日: 2022-02-22
• 發明（設計）人: 付巧妹;曹鵬;戴情燕
• 申請（專利權）人: 中國科學院古脊椎動物與古人類研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京路勝元知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11669
• 代理人: 羅巍;路兆強

1.一種皮張中古DNA的提取方法，包括樣品預處理步驟、消化蛋白步驟、吸附步驟及洗脫步驟；其特征在于：包括如下步驟：

S1樣品預處理步驟：通過該樣品預處理步驟獲得清潔、無外源有機質污染的皮張樣品；

步驟S1所述的樣品預處理步驟包含：

S1-1：采用紫外處理過的無DNA、RNA污染的刀片或剪刀剔除掉皮張表層的毛發，并取20～30mg皮張，剪碎為1mm³皮張顆粒；

S1-2：將所述皮張顆粒置于低蛋白吸附離心管中，加1mL～2mL的70～80％乙醇，高速震蕩洗滌，以＞12000rpm離心0.5min～2min；執行此步驟至少2次；

S1-3：將步驟S1-2離心管敞口靜置于37～40℃培養箱中，充分去除殘留的乙醇；

S2消化蛋白步驟：將protein K/EDTA消化液加入盛裝有皮張樣品的離心管中，封口密封，于35～38℃下振蕩、溫育過夜，以消化本步驟反應體系中的大分子蛋白；高速離心處理去除未溶解的皮張樣品，留取上清液；

所述消化蛋白步驟采用protein K/EDTA消化液，所述protein K/EDTA消化液為包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；所述protein K/EDTA消化液中，蛋白酶K的濃度為0.20mg/mL～40mg/mL，EDTA濃度為0.40mol/L～0.60mol/L，Tween 20的體積分數為0.03～0.08％；

S3吸附：取一定量的所述上清液至盛裝有Binding buffer和乙酸鈉溶液的離心管中并混勻得混合液，接著將該混合液轉移至容納有帶濾膜的吸附柱的離心管中，低速離心處理，使上清液中DNA與濾膜結合，少量小分子蛋白被該濾膜吸附；

所述吸附步驟采用的吸附體系包含Binding buffer、乙酸鈉溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸鈉的混合液中的帶濾膜的吸附柱；所述Binding buffer為包含鹽酸胍、無水乙醇、Tween 20的水溶液；所述濾膜為硅基質濾膜；S4純化：將所述帶濾膜的吸附柱轉移至新的離心管中，中速離心處理并棄去離心產出的清液，去除去濾膜上吸附的小分子蛋白；

S5清洗純化：加PE緩沖液至所述吸附柱的濾膜，中速離心處理并棄去離心產出的清液，再次去除濾膜上吸附的小分子蛋白；執行本步驟至少1次；

S6洗脫：將盛裝所述帶濾膜的吸附柱的離心管進行高速離心干燥，再轉移所述帶濾膜的吸附柱至另一新的離心管內，加TET洗脫液至所述濾膜上，靜置、高速離心；離心產生的清液重新加載至該濾膜上，再次靜置和高速離心，將濾膜上的DNA洗脫，得到含DNA的溶液；所述洗脫步驟采用TET洗脫液，所述TET洗脫液是包含三羥甲基氨基甲烷-HCl、EDTA、Tween 20的水溶液；

所述低速離心是指離心轉速為1000～2000rpm；中速離心是指離心轉速為5000～7000rpm；高速離心是指離心轉速為12000～14000rpm。

2.根據權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Binding buffer中，鹽酸胍的濃度為3～7mol/L，無水乙醇的體積分數為30～50％，100％Tween 20的體積分數為0.03～0.08％。

3.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸鈉溶液為2～4mol/L，其使用量為Binding buffer體積的2～5％。

4.根據權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述TET洗脫液中，三羥甲基氨基甲烷-HCl的濃度為0.005～0.015mol/L，EDTA濃度為0.0008～0.0012mol/L，Tween 20的體積分數為0.03～0.08％。